第四节　鼠疫菌落高通量鉴定

纯培养是解析特定微生物和/或微生物群在宿主健康中作用的关键性步骤。尽管非培养技术宏基因组学已彻底改变人类对微生物的研究，其结果有赖于前期样本的培养保存与取样，不同生物信息学分析方法也对结果产生影响，且不能为进一步的研究提供微生物材料。这些限制都强调了对培养方法的回归，培养组学概念应运而生，其发展为微生物研究提供了新的思路，基于形态学的高通量鉴定是其发展方向之一。

目前，鼠疫耶尔森菌分离鉴定工作中的关键步骤是根据鼠疫耶尔森菌的典型菌落特征，进行肉眼及显微镜下观察，人为识别判断。鼠疫耶尔森菌的菌落形态特征：在固体培养基28℃培养24小时，菌落为针尖样大小。在脑心浸液固体培养基培养48小时后可呈现典型的菌落形态。大的菌落有一个锯齿状的花边，在解剖显微镜下出现铁饼状。随着菌落更进一步生长，菌落中间出现凸起；老的菌落生长出现“油煎蛋”特征。其染色镜下特点为短而粗，中段膨大，两端钝圆并且两级浓染。长1~2μm，宽0.5~0.7μm，有荚膜，无鞭毛和芽孢。这些形态特征依靠人眼无法准确量化，存在依靠检验经验的主观判断情况，可以认为是“半量化-半理性”的，使得微生物检测的所有环节均依赖人工进行，缺乏精确稳定的检验判断依据，且需要消耗大量时间和物力。

机器视觉是人工智能正在快速发展的一个分支。在一些不适于人工作业的危险工作环境或者人工视觉难以满足要求的场合，常用机器视觉来替代人工视觉。目前，机器视觉主要应用于自动光学检查、人脸识别、无人驾驶汽车、产品质量等级分类、印刷品质量自动化检测、文字识别、纹理识别、追踪定位。如基于机器视觉的霉菌自动辨别方法，可以快速、精准识别出霉菌。

由于微生物菌落形态特征较为复杂，如何充分表征微生物菌落形态，如颜色、褶皱等，如何实现机器视觉替代人工视觉“观察”微生物菌落形态，阻碍了机器视觉技术在微生物筛选领域的应用。需识别的目标特征包括但不限于：

1.形态变化性

形态具有变化性，不同生长阶段形态不同。

2.菌种多样性

识别区域内可能包含目标菌种，也可能不包含，也可能混杂其他类型的菌种。

3.分布不确定性

细菌相对图片尺寸小，图片区域内可能包括多种同类细菌，不同类的细菌，不同生长阶段的细菌。

4.高度相似性

在同一个平皿可能同时存在特征高度相似的多种细菌，只有细微特征可区分，其特征对于计算机而言识别难度高。

5.特征抽象性

对于部分细菌，其可区分特征较为抽象，例如光泽度、湿润度、细微光滑度。

6.外部干扰

加样过程需要人为涂刮样品，其路径，形态在成像时对识别细菌有干扰，且其路径、形态具有不确定性。

7.其他干扰

如杂质、手写字体等。

传统图像识别算法包括使用直方图调整对比度、形态变换、卷积变换、Canny边界提取、洪水区域提取。在此调整和初分割的基础之上，对细菌进行特征提取，形成特征矩阵。基于特征矩阵进一步的筛选和优化菌落，排除干扰菌落。在菌落得到精细化分割和定位之后，进一步根据专家知识形成菌种特征矩阵，并将特征转换为国家标准对应的特征，最后根据特征对细菌进行分类。优点在于针对定制性强，可在每个环境针对性的调整算法和参数，识别率高。特别是特征提取部分，针对菌落分类的国家标准，具有较好的符合性。缺点为定制性强，通用性差，开发工作量大。对新数据适应性差，当有新的、差异大的样本数据进入后，算法往往需要大量调整。

传统图像识别算法的针对性强，对新增数据适应性差。传统学习算法在传统图像识别算法基础之上，即菌落得到分割之后，依然根据专家知识提取特征，形成满足国家标准的特征矩阵。与传统图像识别算法不同，学习算法在具有特征输入后，无须人工设置特征阈值，而是形成特征空间，使用主成分分析、支持向量机、DTW曲线分析，甚至可能使用隐马尔可夫状态变迁模型对特征进行分类，但最可能的方法是在特征空间寻找超平面对菌落进行分类。优点在于图像分割、特征提取部分针对性设计强，可以得到较高的识别率。特征提取和抽象部分定制性强，可以符合国家检测标准，无须人工调整参数，特别是在高位特征空间，难以人工寻找合适的参数，但是学习算法可以找到。当新数据加入时，通过重新学习的方法可以适应的新增数据。传统学习算法无须大量的神经网络，对样本数据需要小，计算量小，在识别时，对电脑要求低。缺点是在图像分割、特征提取部分需要大量的针对性的开发工作。在参数学习部分，虽然学习算法可以自动学习参数，然而其数学模型，特别是最小二乘法、雅可比矩阵推导部分，具有较高的要求。

作为深度学习算法在图像识别领域的代表性算法，卷积神经网络对图像具有较好的识别性。典型的卷积框架如SegNet、UNet等，具有分类学习功能。与传统学习算法不同，传统学习算法需要对图像进行预处理、分割、特征提取等定制性开发。卷积网络是基于像素的，只需人工标注，卷积网络通过对输入图片和标注数据进行学习，自动形成网络结构和参数。卷积网络虽然得到广泛的应用，然而其应用领域主要是可人为干扰、或低错误率可接受的场景，一般是针对特征明显的情况。针对高识别率、特征细微、特征抽象（需要特征推理）和分类性较差的领域，如工厂细微质检等精细化领域，直接使用卷积网络并不能取得较好结果。优点在于定制化开发度低，对新增数据适应性强。缺点是细微特征适应性差，可控性差。卷积的网络建立过程是不可控的，无法针对性的对某个领域进行微控。因此，针对细微特征、特征需要推理变换的识别，依然需要针对性的预处理、分割等。但是由于卷积网络的不可预知性，预处理的目标性弱，需要大量的建模、分析和实验来验证。同时，卷积网络是基于像素的网络，其网络的连接功能数目庞大，这需要大量的样本数据作为支撑，也同时需要高端的服务器来进行学习。在运行识别时，对电脑要求高。针对高分辨图片，如分辨率达到4000像素×3000像素的图片，普通配置的电脑计算时间远高于传统学习算法。如果要降低学习时间，需要配置大显存的高端独立显卡。

通过机器视觉在微生物平板菌落形态分析上的应用，可在一定程度上减轻检验工作者的工作强度，同时对于微生物的自动化检验提供可能性。通过对现在微生物的普遍检验程序来看，微生物培养的时间占据了微生物检验的一半以上时间，而微生物检验的其他操作步骤也均需检验人员参与。

微生物的生长是动态的，随着微生物培养时间的延长，微生物菌落在平板上的生长是从无到有，由小到大以及发生颜色、形状变化等菌落特征变化的。因此在微生物菌落生长的初期或中后期其实可以完成相应的计数或定性分析，而自动化控制和机器视觉的结合可以实现微生物平板培养时的过程监控，实现菌落生长变化的记录，通过对这些记录的变化进行分析，即可在一定程度上实现相应的定性或定量分析，从而实现一定程度上对检验人工的替代，并且标准的处理流程可以更好地提高一致性；另一方面微生物菌落形态的识别有助于鉴定方向的选择，并且可以给出初步的鉴定结果有利于后续实验的实际抉择。

微生物自动培养及监控分析系统整合自动化控制和机器视觉技术，可以通过与培养组学结合，在对相关微生物进行研究时，对不同培养条件下目标菌株在平板上的菌落生长情况进行收集、处理，通过不断学习计算机软件算法，与MALDI-TOF质谱结果、测序结果进行一一对应，逐渐建立并完善不需MALDI-TOF和测序仪的微生物定性分析系统，可以在一定程度上减少培养组学的实际应用中对仪器设备的硬件需求，更加满足各种级别的微生物检验实验室的实际需要，以实现微生物的自动化和智能化检验，并提高基层微生物检验的工作效率。