第三节　化学原料药特性鉴定研究的评价

本节内容以新药研究开发为例进行介绍，对应药品注册CTD格式申报资料中“3.2.S.3特性鉴定”部分，包括“3.2.S.3.1结构和理化性质”和“3.2.S.3.2杂质”两个模块，其中，“3.2.S.3.1结构和理化性质”包括了“（1）结构确证”“（2）理化性质”两部分内容。

一、结构确证

结构确证是指验证申报的制备工艺下产品结构的正确与否，保证整个研究工作物质基础的正确性，采用物理和化学手段对制备的化合物进行结构测试，根据取得的数据和结构信息来推论或验证目标化合物的结构。

（一）研究方案的制订

药物结构是千差万别的，制备（获得）方法也各不相同，应根据药物的自身结构特征和制备方法来制订科学、合理、可行的结构确证研究方案。

研究的一般原则就是具体问题具体分析。首先要明晰药物的结构特点，重点需要确证哪些结构问题；根据需要解决的问题来考虑采取哪些有效的研究方法，应充分了解各种研究方法的作用和局限性，以便选择适宜的研究方法和测试手段；一项测试仅是在一个侧面对药物结构特征的说明，需要对各项测试得到的结构信息进行归纳综合、相互补充、相互佐证，以达到对药物结构的全面确证。

例如，对于合成多肽药物，常规的红外吸收光谱法（IR）、紫外吸收光谱法（UV）、核磁共振波谱法（NMR）等研究手段能提供的结构信息比较有限，多肽药物的氨基酸组成、序列等一级结构的信息是重要研究内容，埃德曼（Edman）降解法、基于多种技术的质谱方法是很有效的一级结构研究手段；对于存在半胱氨酸的多肽，应明确巯基的存在状态（氧化态或还原态），含有多个半胱氨酸的多肽，还应确证二硫键的正确连接位点；对于长肽，还可能存在空间结构的研究问题，在研究早期，甚至需要采用合适的体外活性测试方法来确证多肽空间结构的正确性。

对于多组分药物，应确证各组分的组成比例，对各主要成分进行结构确证。例如羟乙基淀粉类产品，它是一系列不同分子量产品组成的混合物，采用常规手段无法直接确证其结构，可从产品的分子量与分子量分布、特性黏度、摩尔取代度、取代方式（C2/C6）等方面进行研究说明。

（二）研究用样品的要求

结构确证研究用样品应具有代表性，应可代表实际注册申报工艺制备的产品。

一般情况下，应采用拟定制备工艺中的精制方法和工艺条件来制备结构确证的研究用样品。对于存在多晶型问题的药物，制备样品用于晶型研究时尤其需要注意，因不同的精制方法和工艺条件可能产生不同的晶型、结晶水/结晶溶剂。对于多组分药物，一般不建议另行进行精制处理，以免影响产品的组成及比例。

研究用样品还应该具有一定的纯度。样品纯度对结构研究非常重要，采用纯度不够的样品进行结构研究可能得到错误的结构信息，或存在的杂质干扰结构的正确解析。样品纯度一般应大于99.0%，杂质含量应小于0.5%。

如结构确证研究中使用了对照品，对照品的结构信息对药物的结构确证亦有重要的佐证作用。结构确证用样品和对照品应在同一仪器采用相同的测试条件下进行测试，以保证对照品的信息对药物结构确证的有效支持。对于从市售制剂中提取、精制得到的结构确证用对照品，因制备过程可能影响其晶型，此对照品不能用于与晶型相关的确证研究。

（三）研究内容和研究方法

对于多数小分子药物，一般是从元素组成、平面结构、立体结构、晶型等方面来确证药物的结构。

1.元素组成

确证组成药物分子的原子种类和数量，以确定药物的分子式、分子量。

经典的方法是元素分析方法，将样品置于氧气流中燃烧，使其有机成分充分氧化，各种元素定量地转化成对应的挥发性氧化物，通过适当的检测手段来定量化合物中碳、氢、氮、氯等的比例，通过计算可得到组成药物的元素种类和含量，即分子式。经比较测试结果与理论计算值的差值大小，可初步判定供试品与目标化合物分子组成是否一致，一般每个元素与理论值的误差不超过0.3%。

高分辨质谱法也是确证元素组成的常用方法，但应保证研究用样品具有一定的纯度，该方法不能反映药物的结晶水、结晶溶剂等情况。

2.平面结构

主要是研究药物分子中各原子的连接顺序和连接方式，确证药物分子的二维结构。紫外吸收光谱法、红外吸收光谱法、核磁共振波谱法和质谱法是常用的研究方法，俗称“四大光谱”。

（1）紫外吸收光谱法（UV）：

测定药物溶液在紫外-可见（190~800nm）区域内不同波长处的吸光度，计算吸收系数（尤其是摩尔吸收系数），可得到药物结构中可能含有的发色团（共轭体系）、助色团（极性基团）种类以及初步的连接方式等信息，该方法也常用于药物的鉴别和含量测定。通过在酸性或碱性溶液中最大吸收波长的紫移或红移现象，还可为药物结构中发色团上存在酸性或碱性基团提供进一步的证据。

（2）红外吸收光谱法（IR）：

测定药物在红外区域（4 000~400cm-1）的吸收光谱，可得到药物结构中可能存在的化学键、官能团及其连接方式的信息，亦可给出药物的几何构型、晶型、立体构型等信息。通常采用压片法、糊法、膜法、溶液法和气体吸收法等进行测定。

盐酸盐药物在采用溴化钾压片法时可能会发生离子交换现象，应分别对氯化钾压片法和溴化钾压片法测得的结果进行比较，并根据结果选择适宜的压片基质。

（3）核磁共振波谱法（NMR）：

是一种基于特定原子核在外磁场中吸收了与其裂分能级间能量差相对应的射频场能量而产生共振现象的分析方法。通过化学位移值、谱峰多重性、偶合常数值、谱峰相对强度和在各种二维谱及多维谱中呈现的相关峰，提供药物分子中原子的连接方式、空间的相对取向等定性的信息。最常用的是氢核磁共振波谱法（1H-NMR）和碳核磁共振波谱法（13C-NMR），可获得药物分子中氢原子或碳原子的数目、相互连接方式、周围的化学环境，甚至空间排列的信息。13C-NMR的无畸变极化转移增强技术（distortionless enhancement by polarization transfer，DEPT）可以进一步明确结构中碳原子的类型（伯碳、仲碳、叔碳和季碳）。

近年来发展的一些二维核磁共振波谱法，例如，H-H COSY可反映出氢原子的偶合情况，H-C COSY可帮助确定各个碳原子所连接的氢原子；HMBC（1H-detected heteronuclear multiple bond coherence connectivity correlation spectra）、HMQC（1H-detected heteronuclear multiple-quantum coherence）等能对氢原子、碳原子的归属提供更多的信息，为复杂结构药物分子的NMR解析提供了很多的便利，也成了药物结构鉴定的重要工具。

结构中含有氟原子、磷原子的药物，还可进行19F、31P的NMR测试。可提供氟原子、磷原子的种类、所处化学环境等信息，对药物元素组成测试亦有佐证作用。

进行NMR测试时需关注溶剂（氘代溶剂）的选择，不仅需要考虑溶剂对样品应有较好的溶解度，还需要考虑溶剂峰（残留质子信号、可能残留的水峰）对图谱解析产生的干扰和对化学位移的影响，尽量避免溶剂峰或残留的水峰对药物部分信号的干扰和掩蔽，尽可能使用高氘代度、高纯度的溶剂。

（4）质谱法（MS）：

是使待测化合物产生气态离子，再按质荷比（m/z）将离子分离、检测的分析方法，可提供药物的分子质量和结构的信息，亦可用于定量测试。用于结构研究的重要参数有分子离子峰、碎片峰、丰度等。

分子离子峰是确证药物分子量、分子式的有力证据，而碎片峰可提供药物结构特征的信息，应根据待测化合物的性质及拟获取的信息类型来选择合适的离子源。目前常用的离子源有电子电离（EI）、化学电离（CI）、快速原子轰击（FAB）、基质辅助激光解吸电离（MALDI）等，其中EI属于硬电离，适用于热稳定的、易挥发化合物的离子化，可产生较多的碎片峰帮助结构特征的解析，但对于有些化合物则得不到分子离子峰。

对含有同位素元素（如Cl、Br等）的药物，利用分子离子峰及其相关峰丰度间的关系，可用于判断药物结构中部分元素的种类、数量。

3.立体结构

对于存在手性的药物，在确证以上平面结构的基础上，还需要对其立体结构进行研究确证。立体结构的确证方法大体可分为两类：直接法和间接法。

直接法是通过某种单一的方法即可确证手性药物的构型，常用的方法是单晶X射线衍射法（single-crystal X-ray diffraction，SCXRD），该方法适用于晶态物质的结构或晶型研究，Cu靶适用于单晶药物的绝对构型测定，Mo靶适用于单晶药物的相对构型测定（含有卤素或金属原子的药品除外）。但采用该方法需要首先制备得到药物的单晶，而有些药物的单晶制备比较困难，可考虑对含有相同立体构型的工艺中间体来制备单晶进行衍射研究，或采用其他间接的方法来确证立体结构。

间接法是指仅靠对供试品进行某一项测试尚难以充分说明其构型，还需综合其他测试数据。例如，比旋度、手性色谱、核磁共振波谱（NMR）、旋光光谱（ORD）、圆二色谱（CD）、化学相关法等都属于间接法。需要根据药物结构特征、已有的信息等来选择合适的测定方法，例如，二维核欧沃豪斯效应谱（nuclear Overhausereffect spectroscopy，NOESY）是一种二维核磁，适用于刚性结构药物的立体构型确证。间接法确证立体构型的示例见图2-4，结合合成原料中两个羟基碳的已知构型，采用NOESY可确证4种产物的五元环上两个新增手性中心的立体构型。

单晶X射线衍射法是药物立体结构确证的直接方法，但并非首选方法，需要根据单晶制备的难易、药物结构特征及其他已掌握的信息（如手性中心的引入方式、化学反应的立体选择性、文献报道等）来灵活制订研究方案、选择研究方法。在采用间接法时，需注意对多方面信息的综合讨论分析。

4.晶型

ICH指导原则《Q6A：质量标准新原料药和制剂的检测以及可接受标准：化学物质》中对多晶型（polymorphism）的定义是：同一种药物以不同晶体形式存在，包括溶剂化物、水合物和无定形物。多晶型现象是普遍存在的，不同的晶型可能具有不同的溶解度，对于难溶性口服固体制剂，原料药的不同晶型可能影响制剂的溶出行为，甚至进一步影响制剂的生物利用度/生物等效性（BA/BE）；不同晶型的原料药可能具有不同的物料特性，如颗粒形态、流动性、堆密度、可压性、引湿性等，当制剂采用混粉直接压片或混粉直接填充胶囊等工艺时，原料药晶型的差异可能对制剂工艺产生较大的影响；此外，不同晶型因化学反应性、引湿性的差异，或因转晶，可能会影响到制剂的稳定性。因此原料药的晶型是药物开发过程中不可忽视的一项研究内容。

晶型的研究方法包括：X射线粉末衍射法（X-ray diffraction of powder，XRPD）、红外光谱法、拉曼光谱法、固体核磁共振波谱（solid state nuclear magnetic resonance，SSNMR）、光学显微镜等。在早期晶型筛选阶段，需联合应用多种分析手段来判断样品是否为单一晶型或混晶，之后再根据不同晶型的特征差异，选择可有效区分不同晶型的方法来表征目标晶型产品。X射线粉末衍射法具有良好的专属性、灵敏度，是最为常用的方法，可用于区分不同的晶体，也可用于混晶的半定量研究。

需要注意样品的处理方式对晶型的影响，例如采用IR进行测试时，如研磨、压片过程会影响样品的晶型，可考虑改用糊法测定，由于糊剂自身有吸收，应根据药物特点对糊剂的种类进行选择。

参考ICH指导原则《Q6A：质量标准新原料药和制剂的检测以及可接受标准：化学物质》，原料药晶型研究决策树示意图见图2-5，以判断原料药的晶型是否是影响制剂安全性、有效性的关键质量属性，是否需要在原料药标准中制订专属性的晶型控制方法。

对于含有结晶水或结晶溶剂的药物，应对药物中的水分或溶剂进行确证研究。常用的研究方法包括：热重、差热分析、干燥失重、水分/溶剂测定、元素分析、核磁共振波谱法、单晶X射线衍射法等。每种方法对结晶水、结晶溶剂的确证均有一定的局限性，需要根据药物结构特点选择合适的方法，同时还需要结合其他不同方法得到的结果进行相互补充和佐证。例如，单晶X射线衍射法可直接提供测试样品中结晶水的数量和存在方式，但由于单晶的制备方法通常不同于拟定的制备工艺，测定结果并不能支持拟定工艺下制备的产品具有相同的结晶形态，还需要结合热重、差热、水分等测定结果来综合分析水分的存在状态（结晶水或吸附水）以及结晶水的数量。

二、理化性质

对原料药理化性质的深入研究是开展质量研究、制剂处方工艺等其他研发工作的基础，通常包括以下研究内容。

（1）性状：

是指对药品的外观、色泽、臭、味等的描述。

（2）熔点：

是固体原料药的一项重要的物理常数。结晶性原料药一般具有明确的熔点（熔距），可用于鉴别原料药及不同晶型。常用传温液加热法、电热块空气加热法进行测定，对于熔点难以判断或熔融同时分解的原料药，应同时采用热分析方法进行比较研究。

（3）旋光度或比旋度：

是手性药物的特性，可用于鉴别或检查手性药物的纯度，亦可用于测定手性药物的含量。旋光度与测定光源、测定波长、溶剂、浓度、温度等因素有关，应注明测定条件。

（4）溶解度：

是药物的一项重要物理性质。通过测定药物在不同种类溶剂中的溶解性能，可供精制用溶剂的选择以及质量检验制备溶液时作为参考。《中国药典》（2020年版）四部凡例中根据药物在溶剂中溶解度的大小，将溶解性能从高到低分为“极易溶解”“易溶”“溶解”“略溶”“微溶”“极微溶解”“几乎不溶或不溶”这六档。测定条件为：除另有规定外，称取研成细粉的供试品或量取液体供试品，于（25±2）℃一定容量的溶剂中，每隔5分钟强力振摇30秒；观察30分钟内的溶解情况，如无目视可见的溶质颗粒或液滴时，即视为完全溶解。

此外，还建议测定原料药在生理pH范围内水中的溶解度，对于溶解性与溶液pH相关的原料药，可绘制表观溶解度-pH的曲线，以指导口服固体制剂的溶出介质的筛选、制剂处方工艺的考察。

（5）渗透性：

对于口服固体制剂，原料药的溶解性影响制剂的溶出行为，而渗透性则影响药物在胃肠道溶出后通过胃肠壁进入体循环的能力。渗透性分类与药物在人体肠道膜间质量转移速率直接相关，与药物在人体内的吸收程度间接相关。可通过人体试验或非人体试验的方法来确定原料药的渗透性分类，人体试验的方法有质量平衡、绝对生物利用度等，当一个口服药物采用质量平衡测定的结果或是相对于静脉注射的参照剂量，显示在体内的吸收程度≥ 85%（并且有证据证明药物在胃肠道稳定性良好），则可说明该原料药具有高渗透性；非人体试验的方法包括：在合适的动物模型的体内或原位肠道灌注、离体肠道组织的渗透性检测或者合适的单层上皮细胞的渗透性测定等。当一个单一的渗透性检测不足以充分说明药物的渗透性类别时，可采用两种不同的分析方法；当不同实验类型的研究结果存在矛盾时，应考虑用人体数据替代体外或动物数据。

基于原料药的溶解性、渗透性分类的生物药剂学分类系统（biopharmaceutics classification system，BCS）对制剂的开发工作具有重要的指导作用，要重视对新原料药溶解性、渗透性的研究，研发早期尽量获得渗透性分类的结果，以用于评估生物药剂学分类，帮助制剂的处方工艺开发。

（6）粒度：

对于水中溶解性较差的原料药，且制剂为固体口服制剂或不溶性原料药的混悬液体制剂，原料药的粒度可能影响制剂的溶出行为，甚至影响生物利用度，也可能影响到制剂的工艺、含量均匀度、产品外观等，必要的话，需要制订原料药的粒度分布的质量控制要求。参考ICH指导原则《Q6A：质量标准新原料药和制剂的检测以及可接受标准：化学物质》，原料药粒度研究决策树示意图见图2-6。粒度的测定可采用显微镜法、筛分法、光散射法，推荐使用激光散射粒度分布仪来测定药物颗粒的粒度分布，注意对方法（湿法测定、干法测定）的选择，并进行必要的精密度、重现性等验证。

（7）晶型：

晶型可能影响固体口服制剂的溶出、制备工艺等，对于存在多晶型现象的产品，应在注册资料中明确拟定采用的晶型。

（8）引湿性：

是指药物在一定温度及湿度条件下吸收水分能力或程度的特性。试验结果可作为选择适宜的药品包材和贮存条件的参考。在《中国药典》（2020年版）四部中，根据药品在（25±1）℃、相对湿度（RH）（80±2）%条件下24小时的吸湿增重百分率，将引湿性分为“潮解”“极具引湿性”“有引湿性”“略有引湿性”“无或几乎无引湿性”。

（9）解离常数（pKa）：

是物质在水溶液中发生解离的平衡常数。多数药物都是弱酸或弱碱盐，解离常数决定着药物在介质中的存在形式，即药物的分子形式和离子形式的比例，影响其溶解性、亲脂性，是一个影响药物在体内吸收和分布的重要理化性质。常用的测定方法包括电位滴定法、电导滴定法等。

（10）分配系数：

是反映物质在两相之间迁移能力的重要理化特征参数。正辛醇-水分配系数（Kow）是在特定温度下，物质在正辛醇相和水相之间达到分配平衡之后，在两相中浓度的比值。Kow反映了药物相对的亲脂或亲水的性能，Kow越低反映药物是亲水的，越高则是疏水的。常用的测定方法有摇瓶法、两相滴定法、萃取法、产生柱法、色谱法等。

新原料药的开发过程中，应特别关注与制剂生产、性能相关的重要理化性质的研究，如溶解性、渗透性、晶型、粒度、引湿性等，为制剂的研究开发打好基础。此外，BCS分类、分配系数等不仅与药物的体内过程密切相关，也在一定程度上影响创新药开发的难易。

三、杂质

任何影响药物纯度的物质统称为杂质。ICH指导原则《Q3A（R2）：新原料药中的杂质》中对新原料药的杂质定义为：存在于新原料药中，但化学结构与新原料药不同的任何一种成分。药品在临床使用中产生的不良反应除了与药品本身的药理活性有关外，有时与药品中存在的杂质也有很大关系。例如，青霉素等抗生素中的多聚物等高分子杂质是引起过敏的主要原因。杂质作为药物的一项关键质量属性，是研发工作的一项重要研究内容。

杂质研究是贯穿于药品研发始终的一项重要内容，按杂质的化学类别和特性，可分为：有机杂质、无机杂质、有机挥发性杂质。杂质谱（impurity profile）分析是对药品中各种可能存在的杂质的概貌掌握，是杂质研究工作的基础，基于杂质谱分析的杂质控制是“质量源于设计”的基本理念在杂质研究与控制中的一种具体实践。通过全面的杂质谱分析，可指引药品制备工艺的开发和优化、质量控制策略的制订；可使杂质检查工作有的放矢，根据不同杂质的特性来针对性地建立检查方法，有助于检查方法的建立和验证。

原料药的杂质谱分析对应于CTD格式申报资料的模块“3.2.S.3.2杂质”，本节按照有关物质、残留溶剂、元素杂质、致突变杂质等不同类型，分别讨论新原料药杂质分析的一般原则和研究思路，不涉及检查方法的研究及验证的内容（相关内容见本书第六章）。

（一）有关物质

图2-7是一个化学合成原料药工艺的有关物质潜在来源示意图。该工艺以A和B为起始原料，经中间体C制备最终产品（API），根据此反应通式，杂质的潜在来源主要包括以下几个方面：①合成原料（A、B）及中间体（C）的残留；②合成原料引入的杂质（如B′），以及合成原料引入杂质的后续反应产物，如B′的后续反应产物C′、API′；③副反应产物，如BP1、BP2等，如果副反应产物可随主成分一同参与后续的反应，还需关注其后续反应产物；④原料药的降解产物，如D1、D2等；⑤反应中使用的试剂、配位体、催化剂等的残留。由于这类杂质的化学结构一般与API类似或具有渊源关系，通常也称为有关物质（related substance）。除了降解产物外，其他四类杂质都与制备工艺有关，也称为工艺杂质。

原料药的杂质谱分析应注意避免两种极端问题，一种极端是杂质分析过于简单，例如，工艺杂质仅关注合成原料和中间体的残留；另一种极端是杂质分析过于繁杂，例如，将有机合成的各种理论可能的副反应杂质均简单罗列，但不做进一步的分析讨论、杂质检查。ICH指导原则《Q3A（R2）：新原料药中的杂质》中明确要求：申请人应对原料药在合成、精制和储存过程中最可能（most likely）产生的那些实际存在的和潜在的杂质进行综述分析。因此，杂质谱分析的对象应是那些最可能产生的工艺杂质和降解产物，而不是工艺中使用的所有物料、试剂的简单罗列，也不是理论上所有可能副反应的简单排列组合。合理的杂质谱分析应建立在对合成所涉及的化学反应、由原料引入的杂质及可能的降解产物进行科学合理评估的基础之上。不仅要关注实际检出的杂质，还需要对潜在杂质存在的可能性进行科学评估，以更有效地指导有关物质检查方法的筛选和建立。

1.工艺杂质

工艺杂质的分析应基于工艺开发过程中知识和数据的积累，对制备工艺以及所涉及化学反应机制要有深入的理解，要注意分析工艺中杂质的形成、去向（是否可随主成分一同进行后续的化学反应）及清除情况。总之，掌握的信息越丰富，就越容易评估哪些是在终产品中最可能存在的杂质。

工艺中使用的合成原料、中间体以及试剂、配位体、催化剂等的残留问题是比较常规的工艺杂质来源，相对比较简单，可参考其他类型杂质的一般研究思路。下面主要对原料药引入的杂质、副反应杂质的一般研究和评价思路进行讨论。

（1）原料引入的杂质：

可根据供应商提供的制备工艺，对外购起始原料可能引入的杂质进行全面的分析和检测，并注意分析起始原料引入杂质在后续工艺步骤中的去向/清除情况，结合后续中间体质量控制实测数据的积累，合理制订起始原料引入杂质的质量控制策略，例如源头控制、过程控制，或在终产品中继续关注。

应重点关注那些可引入后续反应的潜在杂质，通常这类杂质的结构与主成分类似，可随主成分一同进行后续步骤的化学反应，且理化性质也可能与主成分比较接近，后续工艺步骤对其清除能力相对其他杂质来说比较有限，在终产品中残留的可能性也较大，这类杂质也多见用于有关物质检查方法系统适用性的分离度规定中。例如，EP10收载塞来昔布标准中的杂质A就是合成原料引入的苯环间位甲基异构体杂质随主成分一同进行后续反应而产生的工艺杂质，图2-8为塞来昔布和EP10收载塞来昔布标准中杂质A的结构图，因其结构和性质与主成分非常接近，比较难以清除，不仅作为特定杂质规定限度0.4%，还在系统适用性中规定主成分峰与杂质A峰的分离度不低于1.8。

（2）副反应杂质：

可根据工艺开发过程中掌握的工艺认知、对所涉及化学反应机制的理解以及数据的积累，对各步骤可能产生的副反应杂质进行合理分析，并跟踪其在后续工艺步骤中的去向/清除情况，根据多批次跟踪数据的积累，合理制订各工艺副产物杂质的质量控制策略。同样，应重点关注与主成分结构类似、可引入后续反应的副产物杂质。

以马来酸依那普利为例进行说明，图2-9是依那普利工艺副产物杂质分析图，以L-丙氨酸为原料，经酯化、加成、催化氢化、成酰胺等多步反应制备马来酸依那普利原料药。其结构中含有三个手性中心，第二个手性中心是在加成反应中引入，通过溶解性的差异可分离、去除该步骤产生的非对映异构体杂质R，S加成副产物，但是少量残留的该副产物杂质可继续参与后续的氢化、酰化反应，最终生成终产品的R，S，S异构体杂质。此外，在Pd/C催化氢化步骤中，可能发生乙酯水解、苯环氢化的副反应，这些副反应杂质均可参与下一步的酰化反应，最终生成工艺杂质依那普利拉、环己基依那普利。以上工艺副产物杂质产生的可能性较高，根据过程控制及数据积累的情况，还需要考虑制订终产品控制的质量标准，EP10收载的马来酸依那普利原料药标准中R，S，S异构体杂质（EP杂质A，限度1.0%）、依那普利拉（EP杂质C，限度0.3%）、环己基依那普利（EP杂质H，限度0.3%）均作为特定杂质进行了质量控制，系统适用性中还规定了R，S，S异构体杂质（EP杂质A）与主峰的分离度。

2.降解杂质

可通过结构特征的分析以及试验的手段来研究潜在的降解途径和降解产物，稳定性试验、强制降解试验是常用的试验手段。相对于稳定性试验，强制降解试验可在较短的时间内获得大量的有益信息，因此在新药早期研发阶段，强制降解试验是研究潜在降解途径和降解产物的一种有效手段。此外，它还可帮助建立专属性的有关物质检查方法，为制剂的处方、工艺、包材等开发工作提供有益信息。

ICH指导原则《Q1A（R2）：新原料药和制剂的稳定性试验》中说明强制降解试验的内容包括热、湿、氧化、光照、水解等；试验样品可采用固体、溶液/混悬液的状态；对于试验条件，因不同产品的稳定性不同，指南中仅笼统地说明强制降解通常是在比加速试验更剧烈的条件下进行，例如，高温试验条件一般是高于加速试验温度10℃以上（如采用50℃、60℃）。要注意对降解试验条件进行必要的筛选考察，避免要么条件过于剧烈，产生大量无意义的次级降解，要么条件过于温和，未能体现应有的降解，无法达到强制降解试验的研究目的。应根据原料药本身的物理化学稳定性筛选考察合适的强制降解试验条件，通常主成分降解10%左右即可（也有推荐主成分降解5%~20%）。对于比较稳定的药物，也没有必要采用过于剧烈的试验条件使其必须达到某种程度的降解。

仍以依那普利为例进行说明，图2-10是依那普利降解杂质分析图，通过溶液以及固体状态下的降解试验，依那普利的主要降解途径是水解降解，在酸碱条件下首先是酯键的水解，如果条件剧烈，还可能进一步产生酰胺键的水解产物；在酸水解、固体湿热条件下还可见形成内酰胺环合的降解产物。

3.其他

药典等文献也是杂质谱分析的重要参考，可参考文献中报道的同品种或相同结构类型药物的杂质信息。但需要注意的是，由于合成路线可能不同，不建议简单套用文献报道的工艺杂质，需要结合自拟的合成工艺分析是否可能产生与文献报道一致的杂质。例如，因合成工艺不同，USP43、EP10的左乙拉西坦原料药标准中收载了不同的特定工艺杂质，（S）-2-氨基丁酰胺盐酸盐（USP杂质B）和（S）-N-（1-氨基-1-氧代丁-2-基）-4-氯丁酰胺（USP杂质A）是USP收载的特有杂质，（2Z）-2-（2-氧代吡咯烷-1-基）丁-2-烯酰胺（EP杂质B）是EP收载的特有杂质，分别产生于不同的合成路线，表2-2是USP、EP收载的左乙拉西坦原料药的不同特有杂质；毒性杂质2-羟基吡啶（EP杂质C）虽然在USP43、EP10中均有收载，也需要结合自拟制备工艺中是否使用了该合成试剂，来考虑是否有必要作为特定杂质进行研究。

（二）残留溶剂

药品中的残留溶剂是指在原料药或辅料的生产中，以及在制剂制备过程中使用或产生的，但在工艺过程中未能完全去除的有机溶剂。为保障药物的质量和用药安全，需对残留溶剂进行研究和控制。

ICH指导原则《Q3C（R8）：杂质：残留溶剂》、《中国药典》（2020年版）“0861残留溶剂测定法”、NFDA《化学药物残留溶剂研究的技术指导原则》等指导原则中，根据有机溶剂对人体及环境可能造成的危害程度，分为以下四类。

第一类溶剂是指人体致癌物、疑为人体致癌物或环境危害物的有机溶剂。因其具有不可接受的毒性或对环境造成公害，在原料药制备工艺中应尽量避免使用。如工艺中不可避免地使用了第一类溶剂，应进行充分研究证明其不可替代性，无论在工艺中任何步骤使用，均应严格控制残留量。

第二类溶剂是指有非遗传毒性致癌（动物实验），或可能导致其他不可逆毒性（如神经毒性或致畸性），或可能具有其他严重的但可逆毒性的有机溶剂。此类溶剂具有一定的毒性，但和第一类溶剂相比毒性较小，建议限制使用，以防止对患者潜在的不良影响。

第三类溶剂是GMP或其他质量要求限制使用，对人体低毒的溶剂。对人体或环境的危害较小，人体可接受的粗略浓度限度为0.5%。

第四类溶剂是尚无足够毒理学资料的溶剂。该类溶剂的毒性尚未明确，但并非不需要关注其残留的安全性，例如石油醚是低分子量烷烃类的混合物，市售试剂通常是按不同的沸程分为不同规格的产品，其主要成分多为戊烷、己烷、庚烷、辛烷等，其中正己烷为二类溶剂（0.029%），正戊烷、正庚烷为三类溶剂（0.5%），因此需要根据所用石油醚的主要成分来开展残留溶剂的研究。

药品中常见的残留溶剂及限度见表2-3。

对于化学合成原料药，引入残留溶剂的途径主要有以下三种：作为合成原料或反应溶剂引入，作为反应副产物引入，由其他合成原料或其他途径引入。作为合成原料或反应溶剂是引入残留溶剂最主要的途径，而其他两种引入途径常常被忽视，应结合注册工艺分析各种可能引入残留溶剂的途径，例如，作为反应副产物引入，甲酯水解、试剂甲醇钠的使用可能引入第二类溶剂甲醇；原料或溶剂中可能残留的少量毒性溶剂杂质，如甲苯、苯胺中的少量苯杂质，大孔吸附树脂中可能残留的苯、甲苯、二甲苯等。

影响原料药终产物中残留溶剂水平的因素比较多，主要有合成路线的长短，有机溶剂在其中使用的步骤，后续步骤中使用的有机溶剂对之前使用的溶剂的影响，中间体的纯化方法、干燥条件，终产品精制方法和条件等。应结合所用溶剂的类别（危害风险高低）和残留可能性的大小来考虑制订合理的研究策略。对于第一类溶剂，即使是外购起始原料的工艺中使用，也应该进行残留量检测，并制订合理的质量控制策略；对于第二类溶剂，建议对工艺中所有可能的第二类溶剂均进行残留研究，全面掌握产品的质量情况，根据批量生产的数据积累对各种不同第二类溶剂制订相应的质量控制策略；对于第三类溶剂，重点是关注后几步工艺中使用的第三类溶剂，但对于工艺前段使用且相应的后处理操作对其清除能力较差的溶剂，也应关注其检测研究，如二甲基亚砜，其沸点较高，中间体的干燥条件对其清除能力较差。

（三）元素杂质

之前国内习惯称为金属杂质（metal impurity），ICH在2019年发布的指导原则《Q3D（R1）：元素杂质》中进一步扩大了金属杂质的研究范围，包括一些过渡金属和准金属，因此将此类杂质通称为元素杂质（element impurity）。药品中的元素杂质有可能是源自制备工艺中人为加入的反应试剂，如金属催化剂，也有可能是生产设备、包装材料、其他原料/试剂等引入。元素杂质不仅可以反映原料药的纯度，某些还有一定的毒性，因此药品中元素杂质的含量应控制在可接受的限度范围内。

不同的给药途径时，元素杂质对人体的危害风险是不同的，ICH在汇总公开数据的基础上，针对口服、注射和吸入三种给药途径分别制订了各种元素杂质的允许日接触量（permitted daily exposure，PDE），ICH列出的不同给药途径元素杂质的PDE见表2-4。在某些特定的情况下，也可以允许元素杂质水平高于已建立的PDE，例如间歇给药、短期给药（30天以内）、某些特殊的适应证（如威胁生命、尚无有效治疗手段、罕见疾病）等，但应提供充分证据以保证用药者的安全。

基于毒性以及在药品中出现可能性高低的元素杂质分类见表2-5。由表2-5可见，依据毒性以及在药品中出现的可能性的高低，可将元素杂质分为三类。

第1类元素杂质具有明显的毒性，包括砷（As）、镉（Cd）、汞（Hg）和铅（Pb）。在药品的制备工艺中限制使用或不使用，一般是由工艺中的某些原材料引入，例如矿物来源的原料。

第2类元素杂质的毒性与给药途径有关，根据其在药品中出现的可能性，又进一步分为2A和2B两个亚类。

2A类元素杂质在药品中出现的可能性较高，在进行元素杂质的风险评估时需要给予更高的关注度。包括钴（Co）、镍（Ni）和钒（V）。

2B类元素杂质由于自然丰度较低、与其他物料共存的可能性较低，在药品中出现的可能性较低，除非在原料药制备工艺中作为物料加入，一般可不进行风险评估。包括银（Ag）、金（Au）、铱（Ir）、锇（Os）、钯（Pd）、铂（Pt）、铑（Rh）、钌（Ru）、硒（Se）和铊（Tl）。

第3类元素杂质的口服毒性较低，通常PDE高于500µg/d，在口服给药时，除非是制备工艺中作为物料人为加入，一般不需要进行风险评估。但在注射和吸入给药时，如果PDE不高于500µg/d，任何引入该类元素的可能性均需进行风险评估。包括钡（Ba）、铬（Cr）、铜（Cu）、锂（Li）、钼（Mo）、锑（Sb）和锡（Sn）。

此外还有其他一些元素杂质，由于毒性较小或出现的概率较小，还未建立PDE值，包括铝（Al）、硼（B）、钙（Ca）、铁（Fe）、钾（K）、镁（Mg）、锰（Mn）、钠（Na）、钨（W）和锌（Zn）。

可参考ICH指导指南《Q9：质量风险管理》的原则来开展药品中元素杂质的质量控制，风险评估应基于科学的知识和原则，应对产品和工艺有深刻的认识。首先识别产品中元素杂质的已知和潜在的来源；其次检测杂质水平，并与已建立的PDE对比，评估特定元素杂质在产品中的存在状况；进而对风险评估结果进行总结，并判定工艺控制是否完善，是否需要在终产品质量标准中制订元素杂质的质量控制。控制阈值（即PDE值的30%）是风险评估中的一个重要标尺，如数据显示，原料药中各潜在来源的元素杂质水平持续低于控制阈值，可无须制订额外的控制要求。如元素杂质水平超过了控制阈值，则需要根据元素杂质的各种可能引入途径，来考虑制订相应的控制要求，以确保制剂中元素杂质水平持续低于PDE。例如，优化工艺以增强对元素杂质的清除能力；加强物料的质量控制；原料药标准中制订元素杂质的限度控制；选择合适的包装材料等。

（四）致突变杂质

致突变杂质（mutagenic impurity）也称为DNA反应活性杂质（DNA reactive impurity）或遗传毒性杂质（genotoxicimpurity），这类物质具有DNA反应活性，即使在较低水平下也可能直接引起DNA损伤，导致基因突变、诱发癌症。由于安全性的担忧，近年来国内外监管机构对此类杂质都表现出很高的关注度，EMA、FDA相继发布了相关指导原则，在此基础上，ICH于2014年发布了针对致突变杂质的指导原则《M7：为限制潜在致癌风险而对药物中DNA活性（诱变性）杂质进行的评估和控制》，2017年又进一步发布了增补版R1，为致突变杂质的确认、研究和控制提供了指导性建议和技术要求。

首先，应对新原料药在生产、储存过程中实际存在和潜在杂质进行评估，已鉴定的实际存在的杂质应考虑其潜在诱变性；其次，对于可能存在的潜在杂质也应进行评估，以确认是否需要对其潜在诱变性进一步评价。根据致突变和致癌性的杂质分类及其控制措施见表2-6。由表2-6可知，根据已知的诱变性、致癌性数据以及警示结构、试验结果（如AMES试验），可将杂质分为5类，并制订了不同的控制措施。

对于已有致突变致癌性数据或实际阈值证据［如无明显反应水平（no-observed effect level，NOEL）］的杂质，可采用相应的方法计算获得可接受限度（acceptable limit）。

对于尚无研究数据的致突变杂质，可采用毒理学关注阈值（threshold of toxicological concern，TTC）作为工具来确定的每日摄入量，TTC是采用最敏感物种和最敏感瘤种的50%肿瘤发生率（TD50）数据，通过线性外推到十万分之一发生率得到。TTC是一种比较保守的方法，例如，对于一个毒性数据未知的潜在致突变杂质，在每日摄入量低于1.5µg的终生给药的长期暴露下，该杂质的致癌风险低于10-5，基本可忽略不计。致癌风险随杂质暴露量的累积而增加，短期内大量的暴露与终生的低剂量暴露具有相同的致癌风险，基于TTC的1.5µg/d是在终生长期暴露下计算得到的每日可接受暴露量（终生暴露量为1.5µg/d×365d/a×70a=38.3mg），在此基础上，计算制订了less-than-lifetime（LTL）暴露的可接受限度。表2-7列出了不同治疗周期药物的单个杂质可接受摄入量。

如果给药是间歇性的，则可接受日摄入量应根据给药总天数来计算，而不是服用药物的总时间长度计算。例如，2年期间每周服药一次，即104个服药天数，其致突变杂质的可接受摄入剂量为每天20μg。

当药物中含有两个分类2或分类3的致突变杂质时，单个杂质的限度可参见表2-7。当含有三个及以上的分类2、分类3的致突变杂质时，不同治疗周期药物的多个杂质可接受日摄入总量要求见表2-8。

在原料药质量标准中，以上可接受日摄入总量仅适用于分类2和分类3的致突变杂质，有明确可摄入限度的分类1的致突变杂质不计入上述可接受日摄入总量中。

含有某些结构的化合物具有非常高的致癌潜力，需要重点关注，例如黄曲霉素类似物（aflatoxin analogue）、N-亚硝基化合物（N-nitroso compound）、烷基-氧化偶氮化合物（alkylazoxy compound）。基于TTC计算得到的每日可摄入量不适用于此类高风险化合物，需要制订更为严格的限度要求。

应根据对产品和制备工艺的深入理解，针对每种致突变杂质（分类1、2和3的杂质）的产生来源或引入途径，制订合理的控制策略，并建立专属、灵敏的检测方法。可在原料药终产品中进行质量控制（定期检验或常规检验）；也可以是反应原料或中间体的过程控制；有充分证据支持下，确信目前的制备工艺及工艺参数下某种致突变杂质水平一定低于可接受限度，也可不建立标准控制，这种情况多适用于不稳定的杂质（如氯化亚砜遇水完全分解），或是在原料药工艺的早期引入、在后续步骤中被有效清除的杂质。

（康建磊）