第四章　中药毒理学研究

第一节　急性毒性试验

中药毒理研究内容包括急性毒性、长期毒性、特殊毒性、局部毒性和一般药理学研究，见表4-1。

1.急性毒性试验的目的和意义

急性毒性试验是指动物一日内单次或多次（中药或毒性极低的西药等在24小时内分2～3次给药）给药后在7天或14天（如抗炎药、抗疟药或其他死亡时间拖得较长的药物）中，连续观察动物所产生的毒性反应及死亡情况。毒性试验的观察应从定性和定量两方面进行。所谓定性观察就是观察服药后动物有哪些中毒表现、毒性反应出现和消失的速度如何、涉及哪些组织和器官、最主要的可能毒性靶器官是哪个、损伤的性质及可逆程度如何、中毒死亡过程有哪些特征、可能的死亡原因是什么等。所谓定量观察就是观察药物毒性反应与剂量的关系，主要指标有近似致死剂量（approximate lethal dose，ALD）、LD₅₀和致死剂量（lethal dose，LD），以 LD₅₀为主要定量指标（小动物），大动物可用ALD。了解药物单次或短时间内多次给药后，动物所产生的毒性反应及其严重程度，急性毒性试验的目的是为临床安全用药及监测提供一定的参考。

（1）了解新药急性毒性的强度：

任何物质达到一定剂量都可能致死。在前面章节里已经谈及无毒不成药。虽然没有人认为仅根据LD₅₀就可决定毒性大小、分级标准，指标不应是单纯一个LD₅₀或LC₅₀，还应考虑不同有毒中药中毒死亡的起始时间、最长致死时间和平均致死时间，但这些往往被人们所忽略。一般来说，毒性大而快的死亡快，毒性小而慢的则死亡慢，对临床用药也有一定的参考价值。急性毒性还应由中毒或发病及可治愈情况等综合指标作评价。根据中药特点，我国中药的毒性分级标准部分参照夏丽英的《现代中药毒理学》和杨仓良编著的《毒药本草》，依照中药临床中毒症状的程度、LD₅₀的大小、有效量与中毒量的距离、剂量的大小、中毒潜伏期的长短等多项指标，对中药毒性进行分级，见第一章的表1-1，被许多中医药专家采用。

（2）计算新药相对毒性参数：

对有毒中药来讲，LD₅₀越小，毒性越大，对人产生危害的可能性就越大。对药物来说，用相对毒性参数来衡量更有实际意义。相对毒性参数有治疗指数和安全范围等。相对毒性参数越大，则产生毒性所需的剂量与产生疗效所需剂量的比值越大，当然安全范围就越大。尽管称为安全系数或可靠安全系数，但仍被称为不满意的安全界量系数，这是因为具有同一LD₅₀或ED₅₀的量效曲线，其斜率可能相差很大，有时一个药的基本有效量（median effective dose 50，ED₅₀）或肯定有效量（median effective dose 99，ED₉₉）也可能在致死剂量的范围内，这样便不能满意地保证安全。究竟安全系数多大才认为安全性较大，这要对具体药物进行具体分析，而且要根据动物、病情、药物等情况来综合考虑，所以急性毒性试验不只是求出LD₅₀，还应观察动物的整体反应情况。

（3）为临床毒副反应的监测提供参考依据：

通过动物急性毒性反应可以了解中毒症状、起始时间、持续时间和消失时间等，对死亡的对抗试验也可为临床急救措施提供依据，上述对临床观察患者用药后毒副反应的产生有很大帮助。如乌头类对动物的急性毒性产生的心律紊乱反应，临床应用时患者产生心律失常就是提示要减量或慎用，同样临床需采取相应的抢救措施，保证患者安全治疗。可见，详细观察记录动物的急性中毒症状，不仅有助于对临床可能产生的毒副反应监测提供参考，也为寻找毒性靶器官提供参考方向。尽管详细观察记录了动物的毒性反应，但也只是供作参考，因为对药物反应的种属差异决定了预测价值的局限性。毒理学家对动物毒性反应的种属差异印象深刻，不仅在质反应方面，在量反应方面也很明显。经验认为，一个有毒中药的毒性在实验动物中表现出明显的种属特异性时，对人的毒性如何也很难作出判断；反之，如果药物的毒性反应在实验动物中种属差异很小，特别是以体表面积为单位来计算时，种属之间的差别就更小，如一些抗癌中药成分，临床也证明人的中毒剂量与实验动物很接近。又如青蒿素类在各种已观察的动物中均可引起明显的骨髓造血抑制，特别是红系造血抑制，临床也证明人也会产生同样的毒性反应。

有人认为，当不同种属动物对同一种有毒中药的毒性反应接近时，可以设想人的反应可能也在近似的范围之内。当表现出明显的种属差异时，选择首次临床人用量应特别小心。上述看法有一定道理，但万万不能当成规律，药物千变万化，作用环节各不相同，对具体药物只能具体分析，遵循安全第一、循序渐进的原则，从最小剂量进行人体试验，逐渐增量才是可取的。

（4）为长期毒性、蓄积毒性、特殊毒性及药效等试验选择剂量提供依据：

按药政管理法规规定，长期毒性试验的最高剂量必须既能使毒性充分表现出来，又能使大多数动物存活，中剂量应当出现毒性反应，低剂量则要求不出现毒性反应。要选择好剂量是很不容易的，即使通过预试，也不是轻而易举的事。在中药长期毒性试验中，最高剂量做出毒性反应的例子并不多，原因是很多中药确实毒副作用小，另外，长期以来在人们认识上有“误区”，认为中药长期毒性试验能做出毒性来不利于报批，所以很多有关的毒性信息反映不出来，值得警惕。长期毒性剂量设计有多种方法，其中有2种是根据急性毒性试验的结果来设计的，一种是LD₅₀法，另一种是最大耐受量（maximum tolerated dose，MTD）法，剂量设计详见长期毒性的剂量设计部分（见第四章第二节）。蓄积性毒性剂量设计是用1/10 LD₅₀，然后按等比级数1.5倍逐渐递增进行的。生殖毒性试验高剂量的选择原则，即母鼠的MTD（可以产生轻度毒性反应），可从急性毒性中找出。致突变试验中的啮齿类动物微核试验高剂量是1/2 LD₅₀；果蝇伴性隐性致死试验的高、低剂量分别为1/2 LD₅₀和1/4 LD₅₀；啮齿类动物的显性致死试验中，高剂量应导致毒性症状；精原细胞染色体畸变试验中，高剂量应为1/2 LD₅₀。动物短期致癌试验中，高剂量应是MTD。此外，主要药效学剂量限度、一般药理学和药代动力学剂量设计也要参考急性毒性的LD₅₀。

2.急性毒性试验的技术要求

中药急性毒性试验的内容和方法已有很多书介绍过，现就有毒中药急性毒性试验的技术要求提出几点意见，供参考。有毒中药急性毒性试验除了遵循实验设计的三大原则外，还必须注意以下几方面的问题：

（1）药物浓度、给药容量、给药途径：

有毒中药急性毒性试验一般以不等浓度等容量给药，特殊情况下可以等浓度不同容量，剂量应以折合生药量（g/kg）表示，这里应注意单位浸膏（或干粉）所含的生药量，然后用千克体重所给的浸膏或干粉量×单位浸膏（或干粉）所含的生药量来折合生药量（g/kg）。原则上必须和临床给药途径相同。特殊情况下做不到，则应作说明。如肛门栓剂小鼠急性毒性试验，因药学原因及生理条件无法进行时，则要交代清楚，以最大浓度、最大允许量单次给予或用别的途径给予。灌胃一般宜空腹12～16小时，日本为4～6小时，也有学者认为禁食1小时以上，按惯例以空腹12～16小时居多。禁食时间对测定LD₅₀影响很大，有研究表明，给大鼠灌胃NaCl的LD₅₀，禁食时为3.8g/kg，不禁食为6.4g/kg，相差近1倍。中药或复方制剂所采用的助溶剂为水溶性或采用0.2%～0.5%羧甲基纤维素（carboxymethyl cellulose，CMC）混悬液进行灌胃给药，很难制成真溶液，因此限制了给药量，特别是腹腔注射问题较多，很多人将中药或复方的水提物不作任何处理直接腹腔注射测定LD₅₀，这种做法很不科学，腹腔注射的制剂应与静脉注射制剂要求相似，急性毒性试验不同动物给药途径及常用容量和最大容量，详见表4-2。

（2）中毒症状要详细记录：

对中毒症状要作详细记录，这在许多有关急性毒性试验内容的书及试验者中往往被忽略。试验中尤其是对中毒和死亡发生时间、中毒症状、持续时间和恢复时间应作详细记录，如果注射以后不及时进行观察，到第2天，甚至更长时间才观察，此时也许动物已全死亡。试验者要有一定的伦理意识，重视每一个生命个体在试验中提供的毒性信息及对人类科学试验所作的贡献。试验资料仅提供一个LD₅₀是不够的，它只是一个定量的指标，还应有定性指标及可逆性与否等，一个完整的急性毒性试验报告应既有LD₅₀，还应有定性指标的报告。

（3）严格控制实验室环境条件：

试验最好在GLP条件下进行。若不具备GLP条件，应在实验观察室适应2～3天，室温（20±3）℃，相对湿度30%～70%，人工照明12小时，通风应良好，笼具应清洁，饲料及用水应新鲜，否则均会对实验结果有影响。如苯丙胺在15.5℃时测定的LD₅₀为197mg/kg，在27℃时为90mg/kg，相差约1倍；去氧麻黄碱在15.5℃时测定的LD₅₀为111mg/kg，在27℃时为33mg/kg，相差3倍以上。中药及中药复方急性毒性试验条件控制的研究报告不多，今后应加强。群居小鼠和独居小鼠对LD₅₀测定也有影响，尤其是兴奋药，在狭小空间群居造成温度升高引起的相互刺激使毒性增加明显。动物房氨浓度应控制在20ppm以下，或药理毒理人员进去不感到刺鼻，无异常感。若氨浓度 ＞ 200ppm，药理毒理人员无法进去，则肯定易诱发动物生病，长期毒性试验时则更明显。所以鼠笼若以木屑垫底，木屑应消毒，最好每天更换，最长不超过3天，饮水每天更换。每天上下午通风（抽气）至少半小时。

（4）剂量选择：

剂量设计是否合理是实验成功与否的关键，一般先“撒大网”，即用少量的动物（雌雄各2只）求出不死和全死的剂量或10%死亡及90%死亡的剂量（雌雄各5只），然后根据有毒中药的毒性大小决定组距，一般分4～6组。大动物则用6条犬左右，用50%剂量递增，且间隔一个剂量用药，尤其是对毒性大而猛烈的有毒中药则更容易处理。

（5）试验周期：

给药后至少观察2周或更长。时间太短结果往往不可靠。进行急性毒性试验时仅观察24小时，这样短的时间内往往看不到神经系统的毒性，有些有毒中药从得出的LD₅₀看也认为毒性不太大，但在做临床试验时，往往容易出危险。

（6）最大给药量（MTD）：

有些有毒中药毒性较低，测不出LD₅₀，则可测其最大给药量。采用拟推荐临床试验的给药途径，以动物能耐受的最大浓度、最大容量，1次或1日内连续给药2～3次（间隔6～8小时）。如用小鼠测试，动物数不得少于20只，雌雄各半，连续观察14天，对神经系统有毒性的中药可连续观察14天，详细记录动物的反应。动物体重变化是主要客观指标，给药前、后应定期测量并记录，所得结果应列表进行统计分析。为此，试验时应设空白对照组，与给药组进行对比分析。还应计算总给药量（g/kg，按生药量折算），并推算出相当于临床日用量的倍数，综合评价受试药物毒性大小。

3.急性毒性试验中的LD₅₀计算方法及意义

急性毒性试验中的LD₅₀计算方法有白仑法（又称累计法）、米勒和滕特尔二氏法［又称目测法、概率法（对数概率单位绘图法，1944年）］、寇氏法（又称克贝尔法）、点斜法（孙瑞元改良寇氏法，又称综合计算法）、改良寇氏法（顾汉颐改进寇氏法）、韦尔法（又称概率单位法）、Bliss法、Bliss-Finney法（改进Bliss法，又称概率单位加权回归法）、序贯法（又称上、下法或阶梯法）、李其飞尔德和维尔可松法（即图解法，1947年）、何尔恩法（改良维尔法即简化概率单位法）、简单回归法、加权近似法、移动平均法［Thompson（1947）及 Weil（1952）法］。

其中比较常用的有Bliss-Finney法、点斜法、改良寇氏法、何尔恩法，前两种方法较准确。现在因计算机已经普及，Bliss-Finney法是目前首推使用的LD₅₀计算方法。其实，测定LD₅₀准确与否关键在于动物选择、药物称量配制、给药的熟练程度及预试验，至于用何种方法计算，不是根本问题。每一种计算方法在各种药理学试验方法中都有介绍，这里不再一一赘述。

随着对动物毒性试验认识的不断深化，经验日益丰富，以及西方国家动物保护主义者要求减少实验动物的痛苦及消耗的压力不断加强，再加上中药新药开发研究消耗资金的不断上升，制药工业界和毒理学界对药政管理法关于LD₅₀的测定问题提出不同看法。如1981年，国际毒理学界以LD₅₀和急性毒性试验为专题而召开的学术讨论至少有两次，主要倾向是反对把经典的LD₅₀测定列为一切新药安全评价的常规，反对把LD₅₀视为药物的生物学常数。1995年在东京召开的国际GLP协调会议就提出不测LD₅₀也可以，主张以尽可能少的动物获得尽可能多的急性毒性信息。理由如下：

（1）消耗大量的动物：

测定一个药物一种给药途径，一次实验需消耗100只左右（含预试）。Rowan 1983年报告，英国在1977年中，仅测定LD₅₀所用的动物数为23万只，占毒性试验动物总消耗量的23%，占全部实验动物总消耗量的4.26%。他估计全世界每年单用于测定LD₅₀的动物达500万～1 000万只。我国若按100个研究单位计算，每年将消耗40万～50万只小鼠。

（2）仅能获得有限信息：

由于经典LD₅₀测定耗用动物多，无法对每只动物做详细观察。实际上药物单次剂量急性中毒，动物多死于中枢神经系统及心血管系统功能障碍，并不能很好地显示出各自的毒性作用特征。再者，急速死亡，各种器质性变化尚未来得及发展，不能显示出靶器官的病变。如卤代甲烷对小鼠的急性毒性试验，碘代甲烷（CH₃I）对肝脏毒性很大，比CCl₄和CBr₄均大，但动物死于麻醉和急性循环衰竭，而肝损害却表现不出来。相反，毒性较小，致死较慢的CCl₄和CBr₄对肝脏毒性表现明显。

（3）测得的LD₅₀并不精确：

由于许多因素影响测定LD₅₀，所以实际上LD₅₀并不很精确，甚至有的药物因不同国家、不同实验室测定的结果波动很大，后虽经统一实验条件，波动有所缩小，但仍有较大差别。可见，用经典法测LD₅₀不够精确，仅供参考。中药的LD₅₀测定问题也不少，如制剂本身及种类对测定LD₅₀影响很大，由于很多中药或方剂中含有大量的蒽醌类等物质，对肠胃道刺激性很大，动物往往因给药量大死于肠胀气，而其他毒性靶器官损伤很难观察到。