第二节　长期毒理学试验

长期毒性试验，就是反复多次给药于动物，观察药物对动物的毒性反应，一般是指连续给药14天以上。过去将长期毒性试验分别称为亚急性毒性试验、亚慢性毒性试验、慢性毒性试验和终生毒性试验，现各国都改称为长期毒性试验或重复给药的毒性试验。

长期毒性试验可以观察连续反复给药时，实验动物出现的毒性反应、剂量-毒性效应的关系、主要靶器官（如近年来开展的含马兜铃酸中药的长期毒性试验研究）毒性反应的性质和程度、毒性反应的可逆性等；动物的耐受量、无毒反应剂量、毒性反应剂量及安全范围；还可了解毒性产生时间、达峰时间、持续时间及可能反复产生毒性反应的时间、有无迟发性毒性反应、有无蓄积毒性或耐受性等。这充分说明了长期毒性试验在临床前安全性评价和有毒中药研究中的重要地位，也是研究周期最长、困难最大、耗资最高、重复量大的试验，它对于有毒中药毒性作用靶器官、反应的性质和程度、毒性反应的可逆性以及作用机制等起着举足轻重的作用。

一、基本内容和要求

各国对新药临床前长期毒性试验的要求虽然有差别，个别国家差别甚至较大，但大多数国家的基本要求和内容是近似或相同的，过多过繁的要求未必实用或合理，但过少过简则达不到长期毒性试验的目的。下面主要根据我国新药临床前毒理学指导原则的要求，参照国外大多数国家的规定及我们的实际经验作综合介绍。

1.动物

啮齿类动物首选大鼠，非啮齿类动物选用犬（首选Beagle犬，也可用杂种犬），必要时可用猴或其他大动物。动物应写明供应单位及邮政编码、动物品系及动物生产合格证号（杂种犬例外）。大鼠要求6～8周龄，每次试验时体重差异不超过平均体重的20%。试验周期3个月以上，则可选5～6周龄大鼠。Beagle犬一般用4～12月龄，杂种犬龄 ＜ 5年。性别要求各半。

2.饲养管理

饲料应写明供应单位，若自配的应提供配方及成分含量的检测报告。动物室内温度、湿度、光照和通风条件应写清楚。笼养大鼠每笼不宜超过5只，雌雄分开，有条件时单宠饲养，试验前至少适应观察1周。食量每天记录，体重每周称一次。犬单笼饲养，定量喂食，Beagle犬试验前至少驯养1～2周，标准饲料喂养。杂种犬要预先检疫、驱虫，试验前至少驯养1个月。

3.受试药

应写明药名、批号、来源、规格、纯度、理化特性、保存条件及配制方法。对所用的溶媒或其他赋形剂也应注明规格、来源、纯度、批号。受试药应符合临床试用质量标准，应和药效、一般药理、急性毒性、药代动力学研究用药有相同的质量标准。

4.给药途径

一般要求与临床给药途径相同。灌服时可直接灌服，也可将药混入饲料或饮水中，但必须保证受试药分布均匀。在配制饲料或溶于饮水中后药仍应稳定，并要保证计量准确。临床静脉注射（大鼠）时可用小鼠代替，肌内注射或皮下注射时可变换注射部位，特殊情况另作说明。

5.剂量及分组

一般设 3个剂量组，剂量以 mg（ml、IU）/kg（m²）表示。一般以不等浓度等容量给药。

（1）低剂量组：

目的是寻找动物安全剂量范围，为临床剂量设计提供参考。它应高于整体动物最佳有效剂量或预计每天人用量，此剂量下应不出现毒性反应。

（2）中剂量组：

应使动物产生轻微的或中等程度的毒性反应。

（3）高剂量组：

目的是为寻找毒性靶器官、毒性反应症状及抢救措施提供依据，也为临床毒副反应监测提供参考。高剂量应使动物产生明显的或严重的毒性反应，或个别动物死亡。

（4）另设空白对照组：

给予溶媒或其他赋形剂，若所用溶媒或赋形剂有毒性时则增加正常对照组，每组大鼠雌雄各10只，3个月以上应增加到雌雄各20只；用大动物时每组雌雄各3只，大剂量组宜各4只。

6.给药周期

临床给药1～3天，则动物给药周期为14天，1周则为1个月，4周则为3个月，1个月以上需6～9个月。3个月或3个月以上可采取每周6天给药，周日休息。每天给药时间应相同。

7.检测指标

（1）一般观察：

外观体征和行为活动（包括神态萎靡、蜷缩不动或过度兴奋、躁动惊跳、肌肉麻痹或震颤、步态异常等）、皮毛贴身或稀疏竖散、食量、体重及粪便性状、颜色变化。大动物应增加瞳孔、肛温、腹泻、呕吐、流涎、尿、皮肤黏膜（充血、发绀、苍白）、眼、鼻、外阴部的异常分泌物等。群养时应将出现中毒反应的动物取出单笼饲养，发现死亡或濒死动物应及时尸检，一般宜1小时内进行。

（2）血液学指标：

红细胞或网织红细胞计数、血红蛋白（hemoglobin，Hb）、白细胞总数及分类、血小板计数、凝血时间。这里Hb和红细胞压积（hematokrit，HCT）比红细胞（red blood cell，RBC）要稳定可靠，尤其是贫血及血液学障碍时更明显，如促红细胞生成素（Erythropoietin，EPO）实验时就发现此现象。

（3）血液生化指标：

谷丙转氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，GPT）、谷草转氨酶（glutamic-oxaloacetic transaminase，GOT）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、总蛋白（total protein，TP）、白蛋白（total protein，Alb）、血糖（blood glucose，Glu）、总胆红素（total bilirubin，TBill）、肌酐（creatinine，Cr）、总胆固醇 total cholesterol，TCh）。

（4）尿液检查：

对大动物要做尿液检查。

（5）病理检查器官①系统尸检：

应全面细致，为组织学检查提供依据；②脏器系数：心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、甲状腺、胸腺、睾丸、子宫、脑和前列腺；③组织学检查：对照组和高剂量组及尸检异常时要详细检查，其他剂量组在高剂量组有异常时才进行检查，检查器官有心、肝、脾、肺、肾、脑、肾上腺、胰腺、胃、十二指肠、回肠、结肠、垂体、前列腺、脊髓、胸骨（骨和骨髓）、淋巴结、膀胱、甲状腺、胸腺、睾丸（连及附睾）、子宫（连及卵巢）和视神经；④心电图导联：大动物长期毒性试验时必须做这一项。

8.恢复期观察

最后一次给受试物后24小时每组活杀1/2～2/3动物检测各项指标，留下1/3～1/2动物继续观察2～4周，再活杀检查，了解毒性反应的可逆程度和可能出现的迟发性毒性反应。在此期间，除不给受试物外，其他观察内容与给受试物期间相同。引起不可逆损伤者要慎重考虑临床试验问题。

9.检测指标的时间

大鼠3个月以内，一般在最后一次给药后24小时和恢复期结束各进行一次。必要时中间可进行一次；大鼠3个月以上，可在试验中间活杀少量动物（高剂量组和对照组）检测指标。犬的长期毒性试验时则应测正常值2次，即未给药时测2次，给药后1.1～1.5个月测1次，停药测1次，恢复期结束测1次。

10.资料整理

（1）首页写明试验指导者，课题负责人，病理学检查、血液生化指标测定、血液学指标测定及给药观察等负责人的姓名、职称，实验开始及结束日期，实验承担单位，研究室负责人和资料保存单位等。

（2）第二页书写试验摘要。

（3）第三页开始写正文、引言、材料与方法、结果。用设计合理的统计图、表清楚地显示给受试物前、给受试物期间及停给受试物后各项检测指标的测定值（平均数±标准差），以便了解受试物的剂量-毒性关系，有变化的指标应进行统计处理。

（4）应客观地描述尸检及组织病理学检查结果，对各种异常现象可用半定量的方式表述，以便揭示其与剂量和时间的关系。

二、剂量设计

毒理学研究是保证临床用药安全的关键，长期毒性试验是最主要的内容，且难度最大、费时、费力、耗资而复杂，其成功与否的关键是剂量设计。

剂量设计的方法有多种，下面就常见的几种方法作一介绍。

1.药效学有效剂量法

根据药效学（大鼠的药效学）剂量选择，原则上低剂量应略高于主要药效学研究的有效剂量，此剂量下动物应不出现毒性反应，中剂量应高于药效学大剂量。

2.半数致死量法（LD₅₀法）

根据药物急性毒性的LD₅₀决定3个剂量。一般大鼠3个月长期毒性试验中高、中、低剂量可分别采用1/10、1/50和1/100左右的LD₅₀；犬可用大鼠试验用的一半左右的剂量。此法比较粗略，差异大，一般只作预试的参考。当急性毒性和长期毒性试验用的是同一种动物，则参考价值可大些；反之，LD₅₀是小鼠的结果，则对大鼠和犬来讲，因种属差异而造成的误差和风险将更大。一般小鼠的LD₅₀比大鼠和犬的要大，但也有例外，如钙离子拮抗剂和某些有毒中药就可能出现小鼠LD₅₀比大鼠小。

3.药代动力学法（MCD法）

根据药代动力学的结果，参照最大有效安全浓度（effective safe concentration，MCD），如大鼠3个月长期毒性试验时，低、中、高3个剂量可分别采用对大鼠的 1.0 MCD、3.0～6.6 MCD 和 10～20 MCD，犬一般可采用大鼠一半左右剂量。此法有参考价值，但也要注意动物的异同性，尤其是用小鼠的药代动力学结果时更应慎重。此外，有不少药代动力学和长期毒性是同期进行的，甚至是事后补做的，故国内实际用此法的不多。

4.最大耐受量法（MTD法）

用大鼠急性毒性的最大给药剂量，即1个最大耐受量（MTD）、1/3 MTD和1/10 MTD分别为大鼠长期毒性试验的3个剂量，对犬和猴可考虑用大鼠剂量的一半左右，或测出单次给药犬或猴的MTD，方法同大鼠。此法对大部分动物有参考价值，但少数蓄积性大的则不合适。

5.拟用临床剂量法（ACD法）

根据同类型药物或国外资料或拟推荐临床剂量，一般3个月长期毒性试验时，大鼠可采用50～100倍、25～50倍、10～20倍临床剂量，犬可分别采用30～50倍、15～25倍、5～10倍，猴也可用略低于犬的剂量进行，此法参考价值较大，也较常用。

6.等效剂量法

根据人和动物的等效剂量比值，再按一定倍数扩大。此法参考价值较大，尤其是对抗肿瘤、镇痛有毒中药和外用药等更有意义。

上述几种方法是前人在一定条件下对某些药物的毒性研究中总结的经验，有参考价值，尤其是药效学有效剂量法、MCD法、MTD法和ACD法，受到毒理学界的重视。但必须认识到有毒中药千差万别，对具体药物进行认真而细心的预试，才是摸准剂量的关键。

三、剂量用体表面积和体重表示的换算

体表面积的计算公式通常有经验公式和通用公式2种，2种公式计算结果对有些动物是一致的，对有些动物是不一致的，现介绍如下。

1.经验公式计算法

见表4-3，此表从左与表上对应项目计算^［2］。

举例：由大鼠换算成犬的剂量。12kg犬与大鼠相交处为17.8（倍），如某药大鼠剂量为250mg/kg，200g 大鼠给药 250mg/kg×0.2kg=50mg。

50×17.8÷12=74mg/kg

大鼠约为犬用量的3.4倍（等效剂量）。

2.通用公式计算法

式中，S为体表面积（cm²）；W 为体重（g）。

这个公式适用于所有动物，人也用此公式计算，就有可比性，没有人为误差，各国也多数采用这一公式。同样以体重为横坐标，体表面积为纵坐标，按两个公式分别作图，就可以比较其差异。同一体重时采用经验公式计算，小鼠、犬和猴的体表面积要比通用公式大，而大鼠则几乎没有差异。考虑大多数及上述实际情况，建议统一采用通用公式，减少人为误差。

在实际工作中还发现有都不用上述2种公式来计算的，而是按体表面积剂量表示，如将小鼠、大鼠和犬的体质量剂量分别扩大3倍、6倍和20倍，就分别成为小鼠、大鼠和犬的体表面积剂量。经过通用公式的数学推导及计算可知21.5倍、6.6倍和3.3倍，与上述做法基本吻合，但各种动物随体重增长，其体表面积在增加，其体重与体表面积的比率也在不断增加。以大鼠为例，如果实验开始时其体重为120g，则体重与体表面积的比率约为5.5，而到3个月停药时，大鼠体重可增至400g左右，此时的比率就增加到8.2，如果从开始到停药均用每千克给药量的6倍作为每平方米体表面积的给药量显然是不合适的。对犬也是如此。给药时间越长，动物体重变化越大，不合理性也越大。

总之，在以体表面积给药时，在长期毒性试验中可以通用公式计算体表面积。体表面积随体重增加而增加，这是一个动态过程，按实际面积给药，这样的研究资料才是可靠的，并有可比性和相当的参考价值。

四、毒理学实验所遵循的原则

实验设计要遵循三大原则：重复、随机、对照。在进行实验设计之前要做文献及立题依据的工作，这一工作非常重要。前人、他人的工作情况，借鉴的实验方法，对自己的实验方法及思路都有重要的意义，有毒中药的实验同样也遵循重复、随机、对照原则。

1.重复

毒理学实验应当能稳定地重复出来，要求实验本身具有足够例数的重复实验数据，减少实验的干扰因素，可能控制的因素设法控制一致。

（1）动物：

记录动物的品系、体重、年龄、性别、饲料、饲养环境等。国内外目前已有许多研究机构建立了CLP实验室。GLP实验室要求恒温、恒湿、光照自动化控制，有很好的通风、消毒设备，进去后要更换衣服。

（2）药物：

记录药物批号、纯度、剂量、容量、注射速度、酸碱度、温度等，中药研究剂型工艺要稳定，原料药的产地品种要固定。

（3）仪器：

要了解仪器灵敏度、精细度、零点漂移、使用电压方面的情况，这些对试验结果有效数字的报告以及熟练操作等具有重要意义。

（4）人的因素：

对仪器掌握的熟练程度，基础专业知识的掌握程度，对较长时间麻醉动物的实验研究，麻醉药的选择、用量、给药途径，判断麻醉深浅程度等，均会对结果产生影响。一般毒性试验前，先用小批量的动物做预试后再做正式试验。

2.随机

随机就是按随机遇原则进行分组，其目的是使一切干扰因素分配到各组时只受机遇抽样误差的影响，而减少主观因素的影响。一般先将主控因素（体重、性别、模型形成的程度）分属，然后再在每一档中随机取出等量动物分配到各组，使较难控制的因素（如诱发程度、饥饱程度、疲劳程度、雌性周期）得到随机化的安排。

3.对照

（1）意义

1）取得研究指标数据的差异。

2）消除非被试因素对结果的影响。

3）其他作用：①找出综合因素的主要依据；②验证方法的可靠性；③修正实验数据；④找出实验的最佳条件；⑤分析实验中错误的原因。

用溶媒或辅料代替药液同量注射者称为阴性对照，用已知的典型药物代替者称为阳性对照。阴性对照和阳性对照可以随时了解实验条件是否有变化，有利于判断和对比所试药物的作用，有利于对比统计；阳性对照可检查模型形成的情况，也可以与被试药比较。对照组所用动物数与实验组相同或是实验组动物的总和。

（2）种类：

无处理对照（正常对照、非正常对照-模型、处理前后对照）。