第四节　体外毒理学试验方法

一、细胞毒性实验

细胞毒性是由细胞或者化学物质引起的单纯的细胞杀伤事件，不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡机制。有时需要进行特定物质细胞毒性的检测，比如药物筛选。

细胞毒性检测主要是根据细胞膜通透性发生改变来进行的检测，常用以下几种方法：细胞增殖度法、MTT比色法、XTT法、CCK-8法、荧光素发光法，具体检测原理是利用线粒体内部酶的活性，可以将特定的四唑盐类进行转化，然后通过酶标仪进行检测。

1.细胞增殖度法

细胞增殖度法是我国自20世纪80年代就开始运用的细胞毒性试验方法，已广泛应用于目前医疗器械的生物安全性评价中。该方法主要是将细胞接触样品浸提液后，对存活细胞的数量进行测定，用细胞增殖率来推断样品对细胞的毒性作用。

（1）实验方法：

参照文献进行细胞增殖度法，每支细胞培养瓶分别加入一定浓度的细胞悬液，置37℃、5% CO₂培养24小时后弃去原培养液。培养瓶加入不同浓度的实验样品溶液，置37℃、5% CO₂培养箱中继续培养7天。细胞形态学观察和计数：在更换细胞培养液的当天，以及于第2、4、7天进行细胞形态观察和细胞计数。根据各组细胞浓度按下式计算细胞相对增殖率（relative growth rate，RGR）^［5］：

（2）优缺点：

该方法存在对细胞和耗材的消耗较多、实验操作误差较大、试验周期长、耗时多等缺点^［6-7］。

2.MTT比色法

自1983年Mosmann建立MTT比色法以来，由于其简单、经济、无放射性污染等特点，MTT比色法已经成为细胞生物学领域测定细胞生长及增殖情况的常用方法。MTT比色法的原理：活细胞的琥珀酸脱氢酶能使外源性黄绿色的MTT还原降解形成不溶于水的蓝紫色的结晶物质甲䐶（formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能，用二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解细胞中的甲䐶结晶成溶液，用酶标仪在490nm波长处测定其吸光度。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的数量值与细胞数成正比。根据测得的吸光度，来判断活性细胞数量，吸光度越大，表明细胞活性越强。

（1）实验方法：

首先将配制好的细胞悬液接种于96孔细胞培养板（每孔100μl）上，置37℃培养24小时后，弃去原培养液。加入含有不同浓度样品溶液的新鲜培养液进行交换，每孔100μl，置37℃培养48小时后观察细胞形态。弃去培养基，每孔加入含有MTT的培养基，继续培养4小时后吸除原液，加入DMSO，置振荡器上振荡10分钟。用酶标仪在490nm处测定其吸光度，计算细胞的RGR^［8-9］。

（2）优缺点：

与增殖度法相比，MTT比色法由于实际检测所需的细胞量相对较少，试验步骤相对简便，误差小，检测周期短，因此具有一定的优越性，值得推荐作为细胞毒性检测方法^［5］。另外，中药提取物含大量的黄酮类化合物容易干扰比色结果，所以要注意增设对照组，并进行重复试验。

由于MTT经还原所产生的甲䐶产物不溶于水，需被溶解后才能检测，这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲䐶的有机溶剂对实验者的健康也有损害^［10］。为了克服MTT比色法检测的不足之处，近些年又陆续出现了一些新的检测方法，如MTS 法、WST-1 法、XXT 法、Cell Counting Kit（CCK-8）法等，其中 CCK-8 法是应用得相对比较广泛的方法之一^［11］。

3.CCK-8法

是用于测定细胞增殖或毒性实验中活细胞数目的一种高灵敏度、无放射性的比色检测法。CCK-8法应用非常广泛，如药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验以及生物因子的活性检测等。可直接进行测定，实验误差比较小。

CCK-8法的原理：该试剂中含有WST-8，其在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被活细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性、能溶解于组织培养基中的橙黄色甲䐶染料，用酶标仪在450nm波长处测定其OD值。

（1）实验方法：

将配制好的细胞悬液接种于96孔细胞培养板（每孔100μl）上，置37℃培养24小时后，弃去原培养液。加入含有不同浓度样品溶液的新鲜培养液进行交换，每孔100μl，置37℃培养48小时后观察细胞形态。弃去培养基，每孔加入含CCK-8试剂培养基，培养1～4小时，用酶标仪测定各孔在450nm的OD值。利用公式计算细胞存活率：cell viability（%）=（OD-OD）÷（OD-OD）×100%，并利用改良寇氏法计算IC^［10］。

_{样品空白对照空白50}

（2）CCK-8法的影响因素及确定最佳实验条件^［12］

1）实验细胞贴壁率影响细胞增殖检测（CCK-8法）结果，最佳细胞贴壁率应控制在50%～80%之间。

2）加入CCK-8试剂后，孵育时间影响细胞增殖检测（CCK-8法）结果，加入CCK-8后最佳孵育时间应控制在1～4小时之间。

3）其他实验条件：①CCK-8的加入量为培养基的10%，由于加入的CCK-8量比较少，有可能会因试剂沾在孔壁上而带来误差，所以在加完试剂后应轻轻敲击孔板以帮助混匀；②当在培养箱内培养时，孔板最外一圈的最容易挥发，一般情况下，最外圈的孔只加培养基，不作测定孔用。

（3）优缺点：

目前已有报道认为CCK-8法是相对MTT比色法更为简便、快捷且应用成熟的细胞增殖毒性检测的方法，如侯春梅等^［13］在悬浮细胞的增殖检测实验中发现CCK-8法重复性好、灵敏度高，明显优于MTT比色法；检测氟尿嘧啶和奥沙利铂在WiDr、SW620和HT-29等3种癌细胞株中的抗增殖研究中也发现CCK-8法是更灵敏的检测方法^［14］。

1）从实验的条件、操作及试剂的毒性等方面将两种方法进行比较，CCK-8法相对MTT比色法有下面这些优势^［10］：

a.CCK-8法中生成的是水溶性的甲䐶，可以直接检测；而MTT比色法中生成的是不溶于水的甲䐶结晶，需要在加入MTT溶液孵育后吸弃培养液，再加入DMSO来溶解甲䐶，继而进行检测。这不仅使操作变得烦琐，也会因吸弃培养液时导致甲䐶损失或甲䐶溶解程度不完全等原因对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲䐶的DMSO也有一定毒性，对实验者健康会有危害。

b.加入CCK-8试剂孵育时间是1～4小时，通常经过实际实验摸索，0.5～1小时就可以产生较稳定的橙黄色甲䐶，即可进行检测。而加入MTT溶液孵育的时间一般需要4小时，相比CCK-8法而言更费时。

c.CCK-8试剂本身毒性小，对细胞的毒性也相当低，细胞在CCK-8法检测后还可以用于其他细胞增殖的检测实验，如结晶紫检测法、中性红检测法或DNA荧光检测法等。而MTT溶液毒性较大且有致癌性，对实验者的健康有危害，操作时要格外小心，并且MTT比色法检测对细胞是有损伤的，细胞在检测后不能再用于其他实验。

CCK-8法检测的精密度和准确度较MTT比色法更高，而且CCK-8法操作更为简便和快速，对实验者和环境危害低。因而，CCK-8法值得在细胞增殖和药物毒性检测等实验中推广应用。

2）缺点是CCK-8试剂价格较为昂贵，且试剂颜色为淡红色，与含有酚红的培养液颜色极其相似，加入试剂之后不会立即显色，因此很容易造成漏加或者多加，并且CCK-8试剂加入量很少，如果不小心沾到壁上，很可能会导致结果的可重复性不是很好^［15］。

4.荧光素发光法

荧光素发光法原理：腺苷酸激酶（adenylate kinase，AK）存在于所有真核和原核细胞的胞浆中，AK具有激活ADP生成ATP的作用。当细胞受损后，细胞膜发生破损，AK会释放到培养液上清液中。该试剂盒利用荧光素酶和荧光素在ATP作用下可以发光，通过化学发光仪可以定量检测细胞生存能力。

（1）实验方法：

实验时，取对数期生长的细胞在6孔板中培养24小时，弃去培养液，加入含有样品的培养基，培养24小时后，将细胞在含荧光素PBS中洗涤。随后，在室温下避光孵育，荧光素可透过细胞膜并积蓄在活细胞内，用来进行活细胞染色。使用荧光倒置显微镜拍照。荧光素在激发和发射波长测定荧光吸光度^［16］。

（2）特点：

简单、快速；板式检测，可进行高通量。

二、肝切片毒性筛选实验

精密肝切片技术介于器官与细胞水平之间，肝切片包含肝组织内所有类型细胞，保存了完好的细胞基质和细胞间的相互作用，代谢能力比较接近整体器官，在阐明药物与毒物代谢转化、预测药物毒性及比较不同种属间药物作用差异等方面发挥着重要作用^［17］。

实验方法^［18］如下。

1.肝切片的制备

将大鼠断头处死。在无菌条件下取出肝脏，置于预先以氧饱和的冰Kerbs-Henseelti（HK）缓冲液中，持续通氧（95% O₂，5% CO₂）^［15］。于肝右叶中间部位切取一块约20mm×15mm×4mm的肝组织。将肝组织块置于6孔板中，用2%琼脂糖包埋。用生物胶将包埋的肝组织块固定于振荡切片机的切片台上，将切片台置于含HK缓冲液的切片机标本槽中。调整刀片角度18°左右，将刀的前进速度调至最低，振幅调至最大，切片厚度200～400μm，进行肝切片，并用循环泵将缓冲液温度保持在2～4℃。选取完整的肝切片，用6mm打孔器打成大小一致的圆形肝片，用于培养。

2.肝切片活性的检测

（1）MTT 还原能力：

将肝切片置于 12 孔板中，1 片 /孔，每孔中加 1g/L MTT 1.0ml，37℃振荡孵育1小时，弃上清液，每片肝切片再加1.0ml DMSO，37℃振荡溶解1小时，上清液于570nm处测吸光度，肝切片称重，计算吸光度除以肝切片质量，将0小时的数值记为100%，其余时间点的数值除以0小时的数值，作为各个时间点的MTT还原能力的变化百分率。

（2）生化指标：

肝切片用生理盐水制成2%的肝组织匀浆液，参照试剂盒说明书，BCA法测定蛋白含量，全自动生化分析仪连续监测法测定不同培养时间点上清液及组织匀浆液中 GPT、GOT、LDH、GGT 酶活浓度，计算每微克蛋白中 GPT、GOT、LDH、GGT 的漏出率。

（3）影响因素

1）培养液对肝切片活力的影响：曾报道肝切片在BPM培养液中，通过动态培养，其存活时间长达96小时^［17］。也有实验研究发现，不同种类的培养液对精密肝切片活力的影响较大，BPM培养液中肝切片的活性明显高于DMEM及2种Waymouth's培养液，分析原因可能是肝切片需要的营养成分较复杂，仅靠血清供给不足以满足肝细胞的生长要求。而且随着培养时间的延长，肝细胞浆内糖原含量减少，细胞可能处于缺氧状态^［18］。

2）肝切片厚度对肝切片活力的影响：肝切片厚度一般在200～300μm存活时间较长。有研究发现，较薄的肝切片（200μm）MTT还原能力明显高于300μm、400μm厚度的肝切片^［18］。

3）培养液的pH对肝切片活力的影响：培养液的pH对肝切片活力亦会产生一定影响，随着培养时间的延长，肝切片在弱酸性环境中较耐受，培养24小时，与弱碱性培养液中的肝切片活力比较有显著性差异。

4）不同的培养温度对肝切片活力影响不大。

【评价】 与体内试验相比，精密肝切片培养表现出简单、快速、经济的特点，可以作为一种新的快速敏感的技术手段用于药物肝毒性早期预警的实验研究。精密肝切片培养的主要缺点之一是新鲜的肝切片存活时间相对较短，一般都在6小时之内，但中药一般作用缓慢而持久，短时间培养可能较难检测出变化，目前国外有报道通过改良培养基使肝切片的存活时间长达 96 小时^［19］。

三、器官灌流毒性筛选实验

以肝脏灌流为例，肝脏灌流技术在现代药理毒理学研究中已广泛应用。利用灌流方法可以提供在体和离体肝脏所必需的营养成分和生理环境。与肝组织匀浆、肝组织切片、肝细胞分离、肝细胞膜以及肝细胞酶提取等研究方法相比，肝脏灌流方法的特点是肝脏的组织结构和门脉系统、肝血窦及Dise间隙等参与物质转运的结构均不受影响。该技术可用于药物毒性、药物相互作用、胆汁排泄和转运等研究。

1.实验方法

（1）实验动物：

牛、猪、豚鼠、犬、蛙、小鼠、兔子和大鼠均可选用。进行在位的肝脏灌流宜选用大鼠，因为大鼠缺乏胆囊，可以连续地收集胆汁；另外大鼠肝脏大小适中，不需高的灌流速度即可维持灌流；价格经济。

（2）在位肝脏灌流手术程序：

手术是进行肝脏灌流的关键。①用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，剂量为50mg/kg。②仰位固定麻醉大鼠。③下腹部做一切口，向两侧延至膈肌水平，呈“V”形，上翻皮瓣暴露腹腔脏器。④结扎幽门静脉和腹腔动脉。⑤做胆管插管，收集胆汁。⑥游离肝脏系膜缘，切勿损伤肝，在肝肾之间水平的下腔静脉上系一松结。⑦作门静脉插管，立即接通蠕动泵，开始灌流。使肝缺血的时间尽量缩短，一般要求在5秒内完成。插管时勿损伤门静脉；排完气泡。如灌流成功，整个肝脏应呈均匀的棕黄色。灌流速度为10ml/min。⑧一旦开始灌流，即刻在上述松结下切开下腔静脉，让灌流液流出。⑨打开胸腔，切开右心耳，插入导管至下腔静脉内，达肝静脉水平，结扎固定。该导管用于收集流出液，作结果分析用。⑩将下腔静脉上的松结系紧结扎。

（3）灌流方式：

按灌流液循环方式可分为单次灌流和循环灌流两种。按灌流方向可分为正常灌流和逆向灌流两种。正常灌流由门静脉流入肝脏，从肝静脉出肝，在下腔静脉处收集流出液。逆向灌流则从肝静脉入肝，由门静脉或肝动脉出肝。两种方法中以前者常用。

2.肝脏灌流在药物研究中的应用

（1）在药物代谢和毒性研究中的应用：

可以帮助揭示药物在肝脏代谢的Ⅰ相和Ⅰ相代谢物以及相互关系，也用于研究药物的相互作用。如dl-普萘洛尔作用后会使利多卡因的肝脏清除减少。用逆向灌流方法可研究肝脏药物代谢酶的分布状况。如使非那西丁转变为醋氨酚和醋氨酚硫化物的氧位脱乙基酶和硫化酶在肝脏中分布不同，氧位脱乙基酶位于肝小叶中央区，而硫化酶主要在门脉周围区。

（2）用于肝脏中间代谢及药物影响的研究：

如氨基比林、水杨酸盐、苯乙双胍及乙醇可抑制糖异生；四氯化碳降低尿素的生成；戊巴比妥可增加灌流液中谷胱甘肽的生成量。

（3）动力学研究：

肝脏灌流条件及分析均易控制，适用于肝脏代谢和血流动力学的研究。肝脏灌流流量和代谢物生成有一定的关系：肝脏对底物的摄取高时，肝脏清除作用与流量成正比，但流量不影响摄取的大小。肝脏摄取小时，肝脏清除不受流量的影响。另外，药物清除或代谢物清除与血浆蛋白结合作用有关，一般游离部分愈多则清除愈多。但灌流研究表明，高清除物的清除则不受血浆蛋白结合的影响，只有低清除物的清除易受影响。

（4）胆汁排泄及转运研究：

通过肝灌流对胆汁排泄及转运研究表明，肝脏胆汁分泌压力不依赖于分泌入胆汁中的胆盐，是胆汁的非依赖部分。牛磺胆酸盐在肝脏中与白蛋白有相似的分布区。而且，胆酸盐和牛磺胆酸盐相互竞争抑制依赖Na⁺摄入肝脏的机制。此外，胆红素入肝量的增加可使胆汁排泄率、肝脏浓缩作用和胆汁流量成比例地增加。

除了肝脏灌流外，心、肺、肠和肾脏灌流也可借助于同样的方式进行。