第五节　体内毒理学试验方法

一、盐虾毒性分析实验

天然药物可能存在的细胞毒性也能通过盐虾（Artemia Salina）毒性分析实验检测。因为盐虾对各种化学物质的毒性具有高度敏感性，盐虾毒性分析实验已经成为一项方便的基础毒性实验。在许多事例中盐虾的毒性反应与哺乳动物细胞毒性一致。实验方法^［20-21］如下：

（1）材料：

试验样品、盐虾蛋、海盐（38g/L，pH 7.4）、带孔孵化板、吸引盐虾幼虫的照明灯等。

（2）盐虾的孵化：

盐虾蛋应低温（4℃）保存。在此温度下，盐虾蛋能保持多年的活力。孵化板（22cm×32cm矩形盘）充满一半经过滤的盐溶液。盐虾蛋（25mg）撒在此溶液中。孵化板在28℃孵育48小时。

（3）盐虾的细胞毒性试验：

①经过2天孵化，盐虾蛋成熟为幼虫，用移液管吸取幼虫，每瓶10只幼虫，加入含有药物的5ml海水。②培养箱下25～27℃孵育24小时。③孵育24小时后记录存活盐虾的数目。④采用Finney计算机程序分析数据，计算LD₅₀和95%置信区间。⑤孵化开始后盐虾可存活48～72小时，72小时后开始死亡。

【评价】 盐虾隶属节肢动物门甲壳纲卤虫属，是水产养殖中常用的生物活性饵料。卤虫休眠卵可低温长期保存，卵的孵化和幼虫生长发育速度较快，是理想的生物实验材料，其无节幼体被作为无脊椎动物代表进行标准生态毒性测试^［22］。盐虾毒性实验通常作为一种指导提取物分离筛选的工具之一，值得应用推广，是一种快速、便宜、综合性的生物检验方法，并逐步发展为具有生物活性天然药物的显示、分离和检测方法^［20］。

二、斑马鱼毒性实验

传统的新药临床前体内安全性评价一般采用啮齿类动物作为实验对象，该方法虽然具有结果可靠、综合全面等优点，但是其成本较高，并且不适合于高通量的药物筛选与毒性机制的研究。因此急需一种既具有细胞实验的高通量性和经济性，又具有体内实验的可靠性和全面性等优势的模式动物。由于目前斑马鱼已经广泛用于药物毒性研究，本文在此将不再描述具体实验方法，而是仅就斑马鱼模型在一般毒性、发育毒性、神经毒性、器官毒性和生殖毒性等评价中的应用进行了归纳综述，阐述该模型在毒性研究的优势，旨在将斑马鱼模型与药物早期安全性评价相结合，以提高新药研发的效率和安全性，降低新药研发成本，从而更好地推动该模型的应用。

1.斑马鱼的生物学特点及其在药物早期安全性评价中的优势

在生命科学领域，斑马鱼作为一种常用的模式动物，可以弥补体外细胞实验和体内动物实验的各种不足。斑马鱼与人类基因具有高达87%的同源性^［23-24］，其信号转导通路、生理结构与功能等均与哺乳动物高度相似^［25］，这意味着用斑马鱼开展药物实验所得到的结果在多数情况下也适用于人体。同时，斑马鱼实验是一个整体动物实验，它能准确反映待测药物在体内的吸收、分布、代谢及排泄等动态生理过程。所以，利用斑马鱼进行药物早期安全性评价时，其结果比体外细胞实验更可靠。

斑马鱼是一种小型的热带鱼类，对生存的水环境要求不高，培养水的pH在6.8～7.8之间，水温25～31℃。斑马鱼饲养成本低，体外受精，体外发育，胚胎透明且发育快速，胚胎在24 小时内即可发育成形。体外受精约 120hpf（受精后小时 hours post fertilization，hpf）后，各个组织和器官，例如脑、心脏、肝脏、肾脏、胰脏、肌肉和神经系统等均可发育完全^［26］。斑马鱼的以上特点均显示，与其他模式动物相比，利用斑马鱼进行体内药物安全性评价，具有以下优势：药物用量少、给药方便、便于观察和操作、药物筛选周期缩短、实验成本低以及可实现高通量筛选，同时还方便对药物的毒性机制进行研究。斑马鱼幼鱼是目前为止唯一适合微孔板高内涵、高通量和全自动化分析的脊椎动物模型。除此之外，在以动物模型为研究对象进行药物安全性评价时，研究人员需要充分考虑动物保护条例等问题，但人们通常不将受精120hpf前的斑马鱼胚胎看成是动物个体^［27］，因此从这一角度看，在药物早期安全性评价实验中，斑马鱼与啮齿类模式动物相比，也具有明显优势。

2.斑马鱼模型在一般毒性评价中的应用

一般毒性评价包括急性毒性评价和长期毒性评价两部分。早在1984年，经济合作与发展组织（Organization for Economic Co-operation and Development，OECD）的指导手册就已经将斑马鱼列为实验的标准鱼类，并应用于化合物的急性毒性检测。药物的一般毒性评价可以在斑马鱼的不同发育阶段分别进行。将待测药物分别定量、定时作用于斑马鱼的胚胎、幼鱼和成鱼期，随后可以在显微镜下直接观察卵黄囊水肿情况、卵凝结情况、色素形成、尾巴部延展和体节形成等，且可统计孵化率、致畸率、死亡率和LD₅₀等数据，同时还可以记录斑马鱼主要畸形特征^［28-29］。根据已有数据显示，利用斑马鱼胚胎检测非致畸化合物的成功率可达75%，检测致畸化合物的成功率更是高达100%^［30］。

3.斑马鱼模型在发育毒性评价中的应用

斑马鱼胚胎透明，体外发育，最早即是作为模式生物应用于发育遗传学领域。在毒理学研究中发现巴比妥酸和二乙巴比妥酸等均会影响斑马鱼的正常发育^［31］。在斑马鱼的整个发育过程中，其很多器官和系统，例如心血管、肝脏、脑、肾脏和软骨等的形成过程均对药物的介入非常敏感，并且极易产生畸形。斑马鱼在心血管有严重畸形的情况下还可以存活并继续发育较长时间，所以是评价药物发育毒性的有效模型之一。利用斑马鱼对药物发育毒性进行评价时，在加药处理斑马鱼胚胎后，结合活体染料、抗体、荧光示踪等方法，研究者可以直接观察原肠期的血液循环、心跳、脑区形成、体轴形成和细胞运动等胚胎发育事件。

4.斑马鱼模型在神经毒性评价中的应用

斑马鱼的神经传导系统非常敏感^［32］，其大脑整体构造和血脑屏障的结构与功能均与哺乳动物相似^［33］。在胚胎发育早期，斑马鱼的血脑屏障即开始起作用^［34］。研究发现，许多在人体中具有神经毒性的化合物在斑马鱼身上同样起作用。例如维A酸可导致神经元氧化和凋亡；乙醇可引起视神经和运动神经缺陷；新霉素可导致神经元凋亡；戊四唑会导致斑马鱼痉挛，电图变化、行为变化和分子水平改变均与啮齿类动物痉挛模型相似^［35］。

传统的利用哺乳动物来评价神经毒性的方法包括行为学分析、神经组织病理学分析和生物化学分析等，这些方法均费时费力。斑马鱼的神经系统在短时间内即可发育成熟，例如斑马鱼胚胎发育至24hpf时，原代的神经元就开始分化，48hpf时脑室形成，随后到6dpf斑马鱼的整个神经系统已经形成。所以利用斑马鱼可以对药物的神经毒性进行快速、有效的评价。研究药物神经毒性时，斑马鱼胚胎加药处理后，利用微分干涉相差显微镜或特殊染色方法可以直接在体内观察特定神经元和神经突的改变^［36］。由于斑马鱼具有学习、睡眠和药物成瘾等神经性行为^［37］，所以可以通过行为学分析对斑马鱼神经元的功能进行研究。斑马鱼胚胎或是幼鱼的行为学分析可以在多孔板中进行^［38］，便于观察和操作。

5.斑马鱼模型在器官毒性评价中的应用

斑马鱼的各内脏器官在基因水平上与人类具有87%的同源性，各个器官在解剖和分子水平上也已经证实与哺乳动物具有一定相似性^［39］。因此斑马鱼是一种非常理想的药物器官毒性评价模型^［40］。

（1）心脏毒性评价：

心脏是斑马鱼第一个发育并发挥重要功能的器官。心肌收缩、心率和外观形态等均是心脏功能的重要参数指标。由于斑马鱼胚胎和幼鱼透明，因此研究人员均可以在活体斑马鱼上对以上各指标进行实时观察研究。借助微电极，研究人员还可以同时记录斑马鱼的复合动作电位^［41］。统计斑马鱼心跳频率时，可以将活体胚胎或是幼鱼麻醉，然后通过人工计数或是录像记录等方法来进行^［42］。受精后5天的斑马鱼胚胎可以通过非侵入的方式进行心电图检测，从而了解其心肌是否缺血，心室是否肥厚^［43］。

许多研究已表明，在人体中可影响心脏功能的药物大多也可对斑马鱼心脏造成相似影响^［44-45］。例如特非那定和氯米帕明等药物，可以引起斑马鱼心脏收缩性降低，心跳过缓，循环减缓等。研究表明，药物导致的心脏QT间期延长是由于hERG钾离子通道阻断所造成的，在斑马鱼中也存在着类似的zERG基因^［46］；而且几乎所有已知的可造成心脏QT间期延长的药物均能造成斑马鱼心律失常和心动过缓^［47］。

（2）肾脏毒性评价：

尽管斑马鱼的前肾结构较为简单，但是加药处理后，其在肾脏损伤的表型方面与哺乳动物非常类似。例如斑马鱼心脏静脉窦注射庆大霉素后，会引发严重的形态异常和肾脏系统功能异常，具体表现为心包和颅内水肿、肾小球滤过率降低等^［48］；当利用顺铂或是嘌呤霉素等肾毒性药物处理斑马鱼幼鱼时，同样也会造成肾脏损伤^［49］。

（3）肝脏毒性评价：

肝脏是斑马鱼最大的腺体，48hpf肝脏形态基本形成，72hpf肝脏的形态和功能全部发育完全^［50］。而且在斑马鱼肝脏中，存在多种与哺乳动物同源的脂质代谢酶，包括HMG-CoA合成酶、HMG-CoA裂解酶等^［51］；加之斑马鱼与哺乳动物对外源化学物质的防御机制类似，均为酶的诱导和氧化应激，作用机制也类似^［52］。同时斑马鱼中含有94种细胞色素P基因，其中18种基因与哺乳动物同源^［53］，所以利用斑马鱼评价待测药品肝脏毒性时，同样可以使用上述传统的肝脏毒性检测指标。研究表明，甲丙氨酯具有哺乳动物肝脏毒性，将该化合物作用于斑马鱼，其产生的毒性效应与哺乳动物类似^［54］。在6种已知的具有哺乳动物肝脏毒性和2种不具有肝脏毒性的药物研究中发现，斑马鱼对药物肝脏毒性检测的准确率高达100%^［54］。

除了上述脏器组织的毒性研究外，斑马鱼还常常用于胃肠组织^［22］、听觉^［55-56］、视觉^［57］等组织器官功能的毒性评价。

6.斑马鱼模型在生殖毒性评价中的应用

与啮齿类动物不同，斑马鱼发育较快，受精72小时完成孵化，孵化3个月内可达到性成熟，成年斑马鱼的繁殖周期一般只有7天左右，并且雌性斑马鱼一次产卵可多达200个^［26］。因此，利用斑马鱼对药物的生殖毒性进行评价既经济又快速。同时，性腺指数是一个常用的评价斑马鱼性腺功能的生物指标，性腺指数下降表示斑马鱼的垂体、下丘脑或是性腺活性降低。对于性成熟的雌性和雄性斑马鱼而言，产卵量和精子活力及密度分别是评价其生殖能力的常用指标。研究表明，17β-雌二醇和铅等均能抑制成年雌性斑马鱼的产卵量，且具有明显剂量依赖效应；邻苯二甲酸二丁酯和壬基酚等会导致斑马鱼精子数量减少、激活率降低、精子寿命及剧烈活动时间缩短^［58］。卵黄生成期的雌性斑马鱼可分泌雌激素，进而诱导卵黄蛋白原的产生^［59］，而雄性斑马鱼在雌激素或是类雌激素的诱导下，也可以合成卵黄蛋白原^［58］。将待测药品作用于斑马鱼，然后检测雄鱼、幼鱼及非卵黄生成期雌性斑马鱼体内卵黄蛋白原水平的改变，可以作为评价药物生殖毒性的一个灵敏而可靠的方法。许多药物除了直接对亲代斑马鱼的生殖系统造成损伤外，还有可能影响其子代的正常生长发育。因此利用斑马鱼对药物的生殖毒性进行评价时，通常还需对子代胚胎的孵化率、畸形率等进行分析。

综上所述，利用斑马鱼模型对新药进行早期安全性评价，其明显优势是可以提高药物早期毒性预测的可靠性和灵敏度、缩短新药研发周期、降低新药研发成本、提高新药研发的成功率。但该模型也存在着一些不足，由于给药方式主要是将药物溶解于培养水中，药物通过渗透的方式进入斑马鱼体内，因此药物的理化性质尤其是在水中的溶解性与分子量对结果影响较大，存在着假阳性和假阴性的现象，一些脂溶性强和分子量大的药物目前尚不适合采用该模型进行快速评价。